延龄草甾体皂苷抗大鼠急性心肌缺血有效成分的研究

★ 李淑琪 胡凡 文安 张忠立 左月明 王亚芳（.江西中医药大学药学院 南昌330004；.江西省人民医院神经内科 南昌 330006）

延龄草为百合科延龄草属植物延龄草Trillium tschonoskiiMaxim.的干燥根及根茎，其味甘、性平、有小毒，是传统的名贵中药，具有延年益寿的功效［1］。主治头晕目眩、跌打损伤、神经衰弱、脑震荡后遗症等疾病，是恩施土家族著名民间药之一［2］。现代药理研究具有抗氧化、抗衰老、降血压、抗炎镇痛、调节免疫等作用［3-4］。有研究发现［5］，甾体皂苷可增加冠状动脉血流量、促进侧支循环，增加心肌的供血供氧，降低血压及血液黏稠度、改善血脂，减轻心肌缺血程度，具有预防和治疗冠心病的作用。目前关于延龄草抗心肌缺血的活性研究较少，本项目组前期通过结扎大鼠冠状动脉建立急性心肌缺血模型，研究证实延龄草抗心肌缺血的有效部位为85 %乙醇洗脱物［6］，并从有效部位中分离得到指标性和特征性3个甾体皂苷类单体。本实验对延龄草中3个甾体皂苷类单体进行结构确定和抗心肌缺血作用机制的探讨，为新药开发及指导临床用药提供依据。

1 材料

1.1 实验动物 雄性SD大鼠90只，SPF级，体重（330±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2016-0004。

1.2 药材及试剂 延龄草药材于2012年8月采购湖北省神农架地区，由笔者左月明教授鉴定为百合科延龄草属植物延龄草Trillium tschonoskiiMaxim.的根及根茎。地奥心血康胶囊（成都地奥制药集团有限公司，国药准字Z10910051，批号1612013）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号20141224）；红四氮唑（TTC：北京索莱宝科技有限公司，批号：922G037）；PBS磷酸盐缓冲剂（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号4A10A00160）；CK、LDH检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20160615、20160608）。

1.3 仪器 PowerLab8/16生理记录仪（埃德仪器国际贸易有限公司）；ALC-V8S小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司）；Thermo D-37520台式高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；721可见分光光度计（上海悦丰仪器仪表有限公司）；ELX800酶标仪（Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 药品制备 延龄草根及根茎30.0 kg，粉碎后用70 %乙醇回流提取得总提物浸膏5.7 kg，总提物水混悬后正丁醇萃取，正丁醇层经AB-8型大孔树脂梯度洗脱，依次用水、30 %乙醇、60 %乙醇和85 %乙醇梯度洗脱，其中得85%乙醇洗脱部位991.0 g，该部位经各种色谱技术分离得到上述3个量大于100 mg的Y2T、Y3T和Y4T单体化合物，通过核磁、质谱等波谱技术进行结构鉴定，结构分析如下。

Y2T：无 色 针 晶（ 甲 醇 ）。ESI-MSm/z：739.4245［M+H］+，分 子 式 为 C39H62O13。1H-NMR（DMSO-d6，400MHz）δ：5.34（1H，d，J=4.4 Hz，H-6），5.03（1H，d，J=0.8 Hz，Rha-H-1″），4.93（1H，d，J=6.0 Hz，Glc-H-1′），0.95（3H，brs，CH3-19），0.78（3H，d，J=6.8 Hz，CH3-21），0.74（3H，d，J=6.0 Hz，CH3-27），0.73（3H，s，CH3-18）；碳谱数据见表1。以上数据与文献［7］报道的基本一致，故鉴定为偏诺皂苷元 -3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，即重楼皂苷Ⅵ，简称Y2T。

Y3T：白 色 针 晶（ 甲 醇 ）。ESI-MSm/z：885.4827［M+H］+，分子式为C45H72O17。1H-NMR（DMSO-d6，400MHz）δ：5.33（1H，d，J=4.4 Hz，H-6），5.02（1H，brs，Rha-H-1″），4.92（1H，d，J=6.4 Hz，Glc-H-1′），4.70（1H，d，J=2.0 Hz，Rha-H-1′″），0.95（3H，brs，CH3-19），0.78（3H，d，J=6.8 Hz，CH3-21），0.74（3H，d，J=6.0 Hz，CH3-27），0.73（3H，s，CH3-18）；碳谱数据见表1。以上数据与文献［8］报道的基本一致，鉴定该化合物为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→4）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷，简称Y3T。

Y4T：白 色 针 晶（ 甲 醇 ）。ESI-MSm/z：1053.5272［M+Na］+,分子式为 C51H82O21。1H-NMR（DMSO-d6，400MHz）δ：5.32（1H，d，J=4.0 Hz，H-6），5.06（1H，brs，Rha-H-1′′′′），5.02（1H，brs，Rha-H-1″），4.86（1H，d，J=4.0 Hz，Glc-H-1′），4.67（1H，d，J=1.2 Hz，Rha-H-1′″），0.95（3H，brs，CH3-19），0.78（3H，d，J=6.8 Hz，CH3-21），0.74（3H，d，J=6.0 Hz，CH3-27），0.73（3H，s，CH3-18）；碳谱数据见表1。以上数据与文献［9］报道的基本一致，鉴定该化合物为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→4）-α-L-吡喃鼠李糖基（1→4）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷，即重楼皂苷Ⅶ，简称Y4T。

表1 延龄草3个甾体皂苷的13C-NMR数据（DMSO-d6，100 MHz）

2.2 动物分组与给药 将90只健康SD雄性大鼠，按体重随机分为假手术组（Sham）、模型组（I/R）、地奥心血康组 60.00 mg/kg（Contrast）、Y2T高剂量组 29.14 mg/kg（Y2TH）、Y2T 中剂量组 14.57 mg/kg（Y2TM）、Y3T高 剂 量 组 17.14 mg/kg（Y3TH）、Y3T中剂量组8.86 mg/kg（Y3TM）、Y4T高剂量组26.86 mg/kg（Y4TH）、Y4T 中 剂 量 组 14.28 mg/kg（Y4TM），每组10只。给药量为10mL/kg，假手术组、模型组灌予等量蒸馏水，连续灌胃14 d，每天1次。

2.3 动物模型的制备 于末次给药1 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉动物，将动物仰卧位固定于鼠台上，将心电图针状电极插入四肢皮下，连接肢导联。喉部备皮消毒剪开皮肤，钝性分离皮下筋膜、肌肉组织，找到气管，行气管插管术，并接动物呼吸机辅助呼吸，稳定4～8 min后记录一段正常Ⅱ导联心电图。然后胸部去毛、消毒、沿左胸骨中线纵行切开皮肤约2～3 cm缺口，在第4、5肋间钝性分离肋间肌，打开胸腔，用自制圆形取心环掏出心脏。在肺动脉圆锥与左心耳下缘交界，距左冠脉前降支根部1～2 mm处，用6/0缝合线结扎（假手术组只穿线不予结扎）。用心电图监测Ⅰ、Ⅱ导联ST段弓背明显抬高大于0.2 mV且结扎心肌色泽变浅，判定结扎成功后将心脏放回胸腔，排空胸腔积气后迅速夹闭胸腔［10］。

图1 延龄草3个甾体皂苷的结构式

2.4 观察指标

2.4.1 Ⅱ导联心电图 动物麻醉仰卧位固定于鼠台上，四肢皮下插入心电图针状电极，记录正常Ⅱ导联心电图及冠脉结扎后半小时心电图，观察结扎后心电图5、10、15、30 min ST 段及 T 波的变化［11］。

2.4.2 心肌梗塞范围 大鼠心肌缺血3 h后，腹主动脉取血，迅速取出心脏，去除心包膜，用PBS缓冲液洗净心腔积血，滤纸吸干水分，放置-20 ℃冰箱内冷冻7～10 min后取出，迅速将左心室结扎线下部分心肌平行切成厚度约为2 mm的片状，片状心肌恢复室温后置现配的1 %TTC缓冲液中，37 ℃持续避光染色 15 min，每隔 3～4 min 翻动 1 次以便染色均匀。染色后将心肌组织置于4 %多聚甲醛中固定24 h，正常心肌组织被染为红色，梗塞区心肌组织呈苍白色。将心肌组织按顺序置于黑色底板上拍照，采用Image Pro Plus6.0医学图像分析系统对拍照的心肌梗死区面积进行分析，使用count and measure abjects 工具计算梗死区面积及整个心肌面积，心肌梗死率=缺血区面积/心脏总面积×100 %［12］。

2.4.3 CK、LDH活力的检测 大鼠心肌缺血3 h后腹主动脉取血 6 mL，4 ℃静置 2 h 后 4 000 r/min低温离心20 min取上清液，-80 ℃冰箱保存备用。测试时快速解冻血清，使用ELX800 酶标仪试剂盒检测CK、LDH的活力。

2.5 统计方法 利用SPSS13.0统计软件对结果进行统计分析，全部结果均用 表示，心电图以不同时间点测定值与结扎前正常值之差值表示。组间数据比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 延龄草3个甾体皂苷对心肌缺血大鼠Ⅱ导联心电图ST段及T波变化的影响 结果见图2所示，与假手术组相比，I/R组大鼠结扎后5～30 min心电图ST段、T波均显著上升（P<0.01），说明I/R模型造模成功；与I/R组比较，地奥心血康组、Y2TH组、Y2TM组、Y3TH组、Y3TM组、Y4TH组、Y4TM组在结扎后5～30 min心电图ST段、T波均明显降低（P<0.05或P<0.01），具有统计学意义，说明延龄草甾体皂苷Y2T、Y3T、Y4T均有抗大鼠急性心肌缺血作用。

3.2 延龄草3个甾体皂苷对心肌缺血大鼠心肌梗塞范围的影响 结果见图3所示，与假手术组相比，I/R组大鼠心肌梗塞范围显著升高（P<0.01）；与I/R组比较，地奥心血康组、Y2TH组、Y2TM组、Y3TH组、Y3TM组、Y4TH组、Y4TM组均能显著降低心肌梗塞范围（P<0.05或P<0.01），说明地奥心血康和各给药组均能增加缺血区供血和供氧，减小心肌梗死面积，降低心肌缺血性损害。

3.3 延龄草3个甾体皂苷对心肌缺血大鼠血清酶CK、LDH的影响 与假手术组相比，I/R组大鼠在结扎后血清中CK、LDH活力明显增强（P<0.01）；与I/R组比较，地奥心血康组、Y2TH组、Y2TM组、Y3TH组、Y3TM组、Y4TH组、Y4TM组 均能使血清中CK、LDH活性显著降低（P<0.05或P<0.01），说明各给药组具有抗大鼠急性心肌缺血作用。结果见表2。

表2 延龄草3个甾体皂苷对心肌缺血大鼠血清酶CK、LDH活力的影响（ ，n=8）

4 讨论

在心肌缺血实验研究中，心肌外膜损伤，使缺血区的心肌细胞过度极化与非缺血区心肌细胞形成损伤电流引起心电图ST段抬高，而心内膜下心肌缺血则引起T波升高，其中ST段及T波抬高超过正常范围是心肌损伤的心电图特征性表现，常用于判断心肌缺血动物模型的建立是否成功以及评价药物的抗心肌缺血药效［13］。2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）是脂溶性光敏感化合物，能与正常机体组织中的脱氢酶反应呈红色。缺血组织内脱氢酶的活性下降，TTC不发生反应，缺血组织呈苍白色［14］。因此，心肌梗死面积是反映心肌梗死程度的重要指标之一。

CK、LDH广泛存在于心肌细胞内，CK是一个与心肌细胞内能量代谢有直接关系的重要生物酶，而LDH是细胞呼吸链上的重要生物酶。当心肌出现急性缺血时会造成心脏供血供氧匮乏，心肌细胞发生能量代谢障碍和细胞膜通透性增加，各种心肌酶在缺血早期便会外漏而释放入血，它们的活性和外漏程度反映心肌缺血损伤的范围和严重程度［15］。所以，血清中CK、LDH是心肌梗死、心肌缺血的特异性生化指标，既可反映心血管疾病病情的严重程度，也可作为患者预后评价指标并提供临床治疗依据［16］。

本研究表明，大鼠左冠脉前降支结扎后，肢体Ⅱ导联心电图ST段、T波均显著升高，心肌梗塞范围显著增加，血清中CK、LDH活力明显升高，提示心肌缺血造模成功。地奥心血康组，Y2T、Y3T、Y4T的高、中剂量组与模型组相比，大鼠心电图ST段和T波的异常抬高均能显著降低，并能显著减少冠脉结扎所致急性心肌缺血模型大鼠心肌细胞CK、LDH的漏出，抑制血清中CK、LDH的活性，改善损伤大鼠的心肌代谢和细胞结构破坏，降低心肌梗塞范围，显示重楼皂苷Ⅵ（Y2T）、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→4）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷（Y3T）和重楼皂苷Ⅶ（Y4T）具有抗大鼠急性心肌缺血作用。推测其可能的作用机制是扩张冠脉，改善冠脉供血供氧，减小心肌梗死面积；抑制心肌缺血导致的 ST段和T波抬高，改善心脏功能；改善心肌代谢，降低心肌氧耗，降低心肌酶学指标，减缓心肌细胞的缺血性损伤，对心肌缺血起到一定防治作用。