循环毒毒蛇咬伤患者外周血Th1/Th2细胞因子的表达及意义

吕彩萍 姚洪锋* 骆方军 段银波 何玉领 金蓉佳

毒蛇咬伤是常见热带、亚热带中毒性疾病，在世界范围内每年约有270万例发生，死亡人数达8.1万至13.8万［1］。我国每年被毒蛇咬伤患者约10万人次，蛇咬伤重症患者死亡率约10%～15%，另有25%～30%的患者遗留肢体残疾［2］。毒蛇咬伤后，蛇毒毒素进入人体，损害心、肝、肾等重要器官功能，出现脏器功能衰竭甚至导致死亡［3-4］。刘志国等［5］研究发现，毒蛇咬伤危害程度与机体免疫应答相关。淋巴细胞亚群数量、功能发生异常，可导致免疫系统紊乱并发生一系列病理变化，通过抑制毒蛇咬伤患者的免疫反应可能有助于改善该病预后。本研究通过检测分析循环毒毒蛇咬伤患者外周血T淋巴细胞亚群数量及Th1/Th2细胞因子的表达，探讨其在蛇咬伤患者病情评估中的指导意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年3月至2017年10月诸暨市人民医院收治循环毒毒蛇咬伤患者108例，根据国际蛇伤诊断标准分为轻度蛇咬伤组与重度蛇咬伤组。轻度蛇咬伤组，男54例，女28例；平均年龄（50.3±30.5）岁。其中蝮蛇咬伤68例，眼镜蛇咬伤8例，五步蛇咬伤6例。重度蛇咬伤组，男20例，女6例；平均年龄（52.1±28.8）岁。其中蝮蛇咬伤19例，眼镜蛇咬伤4例，五步蛇咬伤3例。另选取同期本院体检健康者30例为对照组，男18例，女12例；平均年龄（49.8±30.6）岁。三组受试者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。（1）纳入标准：①符合《中国毒蛇及蛇伤救治》诊断标准［6］，明确为循环毒毒蛇咬伤；②在蛇咬伤后24 h内入院；③未在外院就诊，包括使用抗蛇毒血清等。（2）排除标准：①有自身免疫性疾病、细菌性感染、病毒性感染及其它可引起炎症的基础疾病；②合并有多器官功能障碍、昏迷、严重心、肝、肾、血液等系统疾病以及精神疾病。本项目经医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法 （1）T淋巴细胞亚群计数检测：采用BD FACSCanto II流式细胞仪，检测患者外周血T淋巴细胞亚群（CD3/CD4/CD8），50 μl标本+20 μl荧光标记抗体试剂于BDCount计数管中，室温避光孵育15 min，加溶血剂450 μl，充分混匀并静置5 min，上机检测并用Canto软件分析。（2）外周血Th1/Th2细胞因子检测：采用人Th1/Th2细胞因子检测试剂盒，基于免疫荧光技术，捕获微球混合液中不同荧光强度的捕获微球表面分别包被白介素2（IL-2）、白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素γ（INF-γ）特异性抗体分别与待测样本中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ特异性结合后，再与PE标记的荧光检测试剂结合。捕获微球、待测样本、检测抗体形成双抗体夹心复合物，利用流式细胞术检测此复合物荧光强度得到待测样本IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ含量。取25 μl标本以及制备的不同梯度稀释的标准品，加入25 μl捕获微球混合液与25 μl荧光检测试剂，涡旋混匀室温避光孵育2.5 h，随后加入1 ml PBS（1M）溶液，200 g离心5 min，弃上清液，加入100 μl PBS溶液，涡旋混匀3～5 s立即上机检测，用BD FACSCanto Diva软件分析结果。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 19.0统计软件。符合正态分布计量资料以（±s）表示，两组比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血T淋巴细胞亚群分布情况比较 重度蛇咬伤组中CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞数量低于轻度蛇咬伤组和对照组，差异有统计学意义（P<0.001）；与轻度蛇咬伤组比较，重度蛇咬伤组中CD4+/ CD8+比例降低，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1。

2.2 各组外周血Th1/Th2细胞因子表达水平比较 重度蛇咬伤组IL-6水平高于轻度蛇咬伤组和对照组，差异有统计学意义（P<0.01）；轻度蛇咬伤组与重度蛇咬伤组血清IL-10水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；重度蛇咬伤组IL-4、TNF-α高于轻度蛇咬伤组和对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

图1 各组外周血T淋巴细胞亚群分布情况比较

图2 各组Th1/Th2细胞因子表达水平比较

3 讨论

蛇咬伤是临床常见外伤之一，根据毒蛇毒液中所含的毒素成分以及临床症状的不同可分为神经毒蛇、血循毒蛇、混合毒蛇3大类。蛇毒素可以引发伤口感染或应激性炎症反应，在炎症过程中，机体免疫状态发生变化，与疾病的发生发展相关。WAIKHOM等［7］研究指出，蝰蛇咬伤的患者存在细胞免疫功能缺陷，可能与T淋巴细胞的数量和质量缺陷及抗原递呈细胞如树突状细胞异常有关。可见循环毒毒蛇咬伤患者体内免疫状态与疾病的发生发展有重要联系。

本资料结果显示，重症循环毒毒蛇咬伤患者CD3+、CD4+T淋巴细胞水平及CD4+/CD8+比值较轻度组和正常对照组明显降低，可能是循环毒毒素抑制T淋巴细胞免疫功能，T细胞活化被抑制。CD4+T细胞亚群为辅助性T细胞（Th），可介导迟发性细胞免疫，并影响机体炎症的发生；CD8+T细胞亚群为细胞毒性T细胞（Tc）或抑制性T细胞（Ts），能抑制炎症的产生。这两种免疫调节细胞的数量及其比例可反映机体内免疫系统功能的状态，两者比例失衡提示机体免疫功能发生紊乱，因此检测CD4+和CD8+T细胞数量对于评价循环毒毒蛇咬伤患者的机体免疫功能具有重要意义。

CD4+T细胞可分化为成熟的Th1和Th2细胞，Th1/Th2细胞可表达不同细胞因子，如促炎性细胞因子（TNF-α，IL-6）和抗炎性细胞因子（IL-10，IL-4）等。机体正常状态下，Th1/Th2处于相对平衡状态，若一方功能增强，另一方的功能便会被减弱，导致Th1/Th2失衡，进而引起细胞因子表达的紊乱［8］。被毒蛇咬伤后，蛇毒素作用可引发患者机体出现不同程度的急性炎症反应［9］。

MONZAVI等［10］研究表明，蝮蛇咬伤患者机体内的IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子水平明显升高，且与病情严重程度呈正相关，可引发局部或全身炎症反应，使用抗蛇毒血清治疗后，上述细胞因子水平明显降低，病情明显改善。刘志国等［5］研究发现，IL-6越高机体损伤越严重，提示炎性细胞因子水平与病情严重程度相关，可以作为评估蛇咬伤患者就诊时病情严重程度的客观指标。本资料结果显示，促炎因子TNF-α、IL-6在重症蛇咬伤患者中均有不同程度的升高，与对照组和轻度蛇咬伤组比较，差异有统计学意义。TNF-α在细胞因子级联反应中发挥重要作用，可以调控其他促炎因子的分泌。TNF-α、IL-6过度表达会刺激机体发生免疫反应，从而加重病情。且轻度蛇咬伤组和重度蛇咬伤组的IL-10浓度高于对照组，这可能是蛇毒毒素刺激炎症反应所致。IL-10是已知最重要的抗炎和免疫抑制性细胞因子，能够抑制TNF-α、IL-6等细胞因子的表达，减轻炎症反应，起到抗炎作用［11］。监测循环毒毒蛇咬伤患者外周血Th1/Th2细胞因子的表达和T淋巴细胞亚群分布情况，有助于评估患者的病情严重程度。