肠道病毒71型感染手足口病患儿血清Th17 Treg细胞表达与病情程度相关性及预后评估

富凡春 陆许贞 沈亚 王柯尹 富冯峰

手足口病（HFMD）是一种多发于<5岁儿童的常见传染病，主要是由肠道病毒71型（EV-A71）和柯萨奇A组16型（CV-A16）病毒感染引起，重症患者病死率高［1］，严重危害儿童的身体健康。HFMD发病机制主要为，EV-A71或CV-A16病毒与感染者咽部及肠道上皮表面SCARB2和PSGL-1受体结合，经内吞作用进入上皮细胞，入侵人体各个系统，引发组织和器官炎症反应，进一步导致相应的临床表现［2］。研究表明，T淋巴细胞亚群参与HFMD病情发展及预后［3］。Th17细胞是一种可分泌白介素17（IL-17）的T细胞亚群，在机体自身免疫反应和防御反应中起重要作用。Treg细胞是一种调节机体自身免疫反应的细胞，其功能异常可引起自身免疫性疾病［4］。本文探讨Th17和Treg细胞在HFMD患儿血清中的表达情况，并分析其与病情严重程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月至2020年3月本院确诊HFMD患儿80例，HFMD诊断参照国家卫生健康委员会发布的手足口病诊疗指南（2018年版）［5］。根据此指南将患儿分为轻症组42例，重症组38例。轻症组患儿男22例，女20例，平均月龄（29.76±16.96）个月。重症组患儿男21例，女17例，平均月龄（31.42±15.91）个月。选择30例同期体检健康患儿为对照组，其中男

17例，女13例，平均月龄（30.98±19.75）个月。各组患儿性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。对HFMD患儿进行3个月随访，治疗后体温正常，皮疹减少或消失，无遗留后遗症的76例患儿为预后良好组，存在后遗症的4例患儿为预后不良组，其中1例为遗留斜视，3例为肢体肌力下降。入组患儿临床表现和体征与手足口病诊断标准一致，咽拭子EV71特异性核酸检测阳性或血清EV71特异性IgM抗体阳性。均排除有器质性或免疫性疾病。

1.2 方法 所有HFMD患儿在入院第1天采集外周血2 ml，置入含有肝素的抗凝血管中，用于Th17和Treg细胞含量检测。对照组体检儿童外周血采集方法与HFMD患儿相同。（1）采用流式细胞仪检测外周血Th17细胞含量。取2 ml抗凝全血，采用Ficoll密度梯度离心法分离患儿外周血单核细胞，计数后将细胞的密度用DMEM培养基调整至2×106个/ml，取2 ml的细胞悬液加入至6孔板中，再加入1 μg/ml离子霉素、100 ng/ml的佛波酯和1 g/ml的莫能菌素刺激，于37℃、5% CO2培养箱中培养8 h，收集细胞。用PBS重悬细胞，取100 μl的细胞悬液，加入CD3-PC抗体5 μl和CD8-FITC抗体5 μl，混匀后室温避光静置30 min，PBS洗1次，再加入100 μl破膜剂A，混匀后室温避光静置15 min，1500 r/min离心5 min，收集沉淀。PBS洗1次，加入10μl IL-17-PE抗体和100 μl破膜剂B，混匀后室温静置30 min，PBS洗2次。用500 μl PBS重悬细胞，上机，用流式细胞仪检测外周血CD3+CD8-IL-17+Th17细胞的百分比。（2）采用流式细胞仪检测外周血Treg细胞含量。取100 μl的抗凝全血加入至流式管中，再加入CD4-PE抗体5 μl和CD25-PC5抗体5 μl，混匀后室温避光静置15 min，PBS洗1次，再加入100 μl破膜剂A，混匀后室温避光静置15 min，1500 r/min离心5 min，收集沉淀。用3 ml Fix/Prem缓冲液洗1次。加入20 μl Foxp3 McAb-FITC和100 μl破膜剂B，混匀后室温静置20 min，加入3 ml Fix/Prem缓冲液，1500 r/min离心5 min，收集沉淀。用500 μl PBS重悬细胞，上机，用流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的百分比。对HFMD患儿进行3个月随访，分析预后良好组和预后不良组患儿出院前最后一次收集外周血中Th17细胞和Treg细胞的含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料用（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，LSD多重比较；两组间比较采用t检验。计数资料用［n（%）］表示，组间比较用χ2检验。采用Spearman等级相关分析Th17和Treg细胞含量与HFMD患儿病情严重程度的相关性，Rs值>0.7表示高度相关，0.4

2 结果

2.1 各组患儿Th17细胞含量比较 见图1。

图1 三组患儿CD3+ CD8- IL-17+ Th17细胞百分比比较

2.2 各组患儿Treg细胞含量比较 见图2。

图2 三组患儿CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞百分比比较

2.3 各因子与病情严重程度的相关性分析 Th17细胞百分比与病情严重程度呈中度正相关（Rs=0.489，P=0.009），Treg细胞百分比与病情严重程度呈低度负相关（Rs=-0.307，P=0.031）。见图3。

图3 Th17和Treg细胞含量与HFMD病情严重程度的相关性分析

2.4 不同预后患儿血清Th17细胞含量比较 见图4。

2.5 不同预后患儿血清Treg细胞含量比较 见图5。

图4 CD3+ CD8-IL-17+ Th17细胞百分比与HFMD患儿预后关系

图5 CD4+ CD25+ Foxp3+Treg细胞百分比与HFMD患儿预后的关系

3 讨论

HFMD是一种全球性常见传染病，好发于婴幼儿，重症病例患儿大多均由EV-A17病毒感染引起，HFMD重症患儿的病情恶化迅速，其病死率高。因此早发现、早治疗是挽救HFMD患儿生命的重要措施。HFMD患儿多伴随免疫系统的功能紊乱，因此临床对其治疗，除抗病毒治疗外，给予免疫调节性药物常可显著改善病情［6］。

Th17属于T淋巴细胞亚群，是由CD4+T细胞在经过抗原呈递细胞的刺激后分化形成的效应T细胞，主要分泌致炎细胞因子IL-17，对于引发炎症反应具有关键性作用。本资料显示，轻症组和重症组患儿血清Th17细胞百分比显著高于对照组，表明Th17细胞含量随HFMD病情严重程度的增加而增加。此外，Spearman相关性分析显示Th17细胞含量与病情严重程度呈中度正相关。提示Th17细胞在HFMD的发病过程中起促进作用，这与何媛等［7］研究结果一致。推测Th17细胞在HFMD发病中的作用机制可能与其分泌的致炎因子IL-17密切相关，IL-17经Th17细胞分泌后，进一步激活T细胞，并刺激成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞等细胞产生IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子、IL-6等多种炎症因子，诱导炎症的产生［8］。IL-17还可与其受体结合，激活MAPK信号途径及NF-B信号途径引发炎症。此外，IL-17还可介导中性粒细胞的动员过程引发组织炎症反应。这些研究均表示Th17分泌的IL-17可以通过多种途径诱导机体炎症反应，本资料中Th17细胞含量随HFMD病情严重程度的增加而增加，提示在HFMD病情发展过程中，由Th17细胞分泌的IL-17致炎因子诱导的一系列炎症反应可能在HFMD病情进展过程中起重要作用，因此临床在治疗期间，除抗病毒治疗外，还应考虑抗炎治疗，这与王佳［9］提出的HFMD治疗方案一致。

Treg细胞属于T淋巴细胞亚群，是由CD4+T细胞在经过抗原呈递细胞的刺激后分化形成的效应T细胞，主要执行的是免疫抑制的效应。本研究中与轻症组和重症组患儿血清Treg细胞百分比低于对照组，表明Treg细胞含量随HFMD病情严重程度的增加而降低，这与以往研究结果一致［10］。此外，Spearman相关性分析显示Treg细胞含量与病情严重程度呈低度负相关。Treg细胞主要通过主动调节正常机体中自身反应性T细胞的过度活化和增殖，进而调控机体的免疫反应，是维持机体免疫平衡的重要细胞。本资料中Treg细胞含量随HFMD病情严重程度的增加而降低，提示在HFMD病情发展过程中，维持机体免疫稳态的Treg细胞含量降低，进而导致免疫功能的紊乱。但Treg细胞含量降低的机制尚不清楚，推测可能与细胞凋亡和细胞坏死有密切关系，具体机制还有待进一步研究。

本资料结果显示，预后不良患儿血清中Th17细胞含量高于预后良好患儿，预后不良患儿血清中Treg细胞含量低于预后良好患儿，提示Th17细胞和Treg细胞含量在评估HFMD的预后方面具有一定价值，当Th17细胞和Treg细胞含量未恢复至正常水平时，可能导致HFMD患儿预后不良。

综上，外周血Th17细胞含量随HFMD病情严重程度的增加而增加，与HFMD病情严重程度呈正相关，与预后呈负相关。外周血Treg细胞含量随HFMD病情严重程度的增加而降低，与HFMD病情严重程度呈负相关，与预后呈正相关。以Th17细胞和Treg细胞为靶点对HFMD的治疗及预后评估具有重要的意义。