CPNE1蛋白在肺腺癌组织中的表达及临床意义

许正卿 周敏 宋鹏涛 王金志 刘顺林*

肺癌是导致癌症死亡的主要恶性疾病。非小细胞肺癌是肺癌的主要病理类型，腺癌占比最高［1-2］。由于肺癌的发病率和病死率较高，早诊断早治疗，对患者预后起重要作用。作为Copines家族中第一个被发现的成员，CPNE1在骨肉瘤中具有重要的临床意义［3］，但目前尚未发现其在肺癌中的作用。本实验采用免疫组化方法检测CPNE1蛋白在肺腺癌组织与肺正常组织中的表达情况，并结合临床资料进行分析，初步探讨CPNE1在肺腺癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 肺腺癌石蜡组织标本收集 收集于浙江省湖州市中心医院、浙江省安吉县人民医院2006年至2009年外科切除且经病理确诊的人肺腺癌石蜡包埋标本128例，所有患者术前均未进行放、化疗。样本中男67例，女61例，年龄22～80岁，平均年龄61岁。正常肺组织30例，男20例，女10例；年龄46～74岁，平均年龄60岁。所有组织标本均经两位有经验的病理科医生证实。所有标本均按照2009年国际抗癌联盟（AJCC，2009）TNM分期标准进行临床分期，Ⅰ、Ⅱ期69例，Ⅲ、Ⅳ期59例；按分化程度低分化65例，高、中分化63例。

1.2 试剂与方法 实验所用组织蜡块经连续切片成4 μm厚度后进行免疫组化染色，免疫组化试剂盒及兔抗人CPNE1多克隆抗体购自Santa Cruz公司（美国）。采用免疫组化方法检测CPNE1蛋白在肺癌组织中的表达，抗体稀释液代替作为阴性对照。

1.3 免疫组化结果判定 CPNE1蛋白在肺腺癌组织及肺正常组织中免疫组化结果判断标准参考YU等［4］报道方法。CPNE1蛋白阳性表达为在细胞质及细胞膜上呈现棕黄色或棕褐色颗粒。在高倍镜下（SP×400）观察下，以5个不同视野为随机采取对象，计算阳性细胞总数，按照阳性细胞数所占百分比计算分值：1分为阳性细胞所占百分比<10%，2分为阳性细胞所占百分比>10%且≤50%，3分为阳性细胞所占百分比>50%且≤75%，4分为阳性细胞所占百分比>75%；同时，按照染色强弱不同程度计算分值：1分阴性，2分弱染色，3分中等强度染色，4分强染色。通过上述两种不同计算分值乘积判断结果：<4分为（-）；4～8分为（+）；>8～12分为（++）；>12～16分为（+++）。高表达为（++）和（+++）级；低表达为（-）和（+）级。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，用独立样本t检验；计数资料用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CPNE1在肺腺癌组织与肺正常组织中表达 CPNE1蛋白表达主要定位在细胞质中，在细胞膜表达较少，见图1。低表达49例（38.28%），高表达79例（61.72%），30例肺正常组织均为低表达。

2.2 CPNE1表达高低与患者临床病理参数的相关性 CPNE1蛋白的表达与肺腺癌组织临床分期（P<0.05）、TNM分期（P<0.05）、远处转移（P<0.05）存在相关性，见表1。

图1 CPNE1在肺腺癌组织与肺正常组织中表达

表1 CPNE1表达与临床病理资料的相关性［n（%）］

3 讨论

据最新的全球肿瘤发病统计资料显示，肺癌的发病率和死亡率居各种恶性肿瘤的首位，而且对其能做出早期诊断和预后判断的有效分子标志物极少。根据目前的研究，多种癌基因和抑癌基因突变在肺癌的发生发展中起相当作用，如癌基因K-RAS、EGFR、PD-L1，抑癌基因突变TP53、RB等［5-6］。近年来，研究认为肺癌是一种具有异质性的疾病，不同癌基因、抑癌基因参与不同患者的发病，即便是同一个患者肺癌的发病过程中，也可能存在不同的癌基因或抑癌基因参与［7-9］。目前所知的癌基因、抑癌基因突变并不能解释所有的肺癌发生发展，这也提示存在不为所知的基因参与到肺癌的发病中。

CPNE蛋白家族（Copines）是一类磷脂结合蛋白，家族成员均有共同的结构特征：C末端有1个A结构域，与整和蛋白胞外区段的A结构域间具有较高的同源性；N末端有2个C2结构域，与具有Ca2+依赖和磷脂结合特性的C2结构域具有高度相似性。整和蛋白的A结构域能与Ca2+和Mg2+结合，也是整和蛋白与胞外配体发生蛋白相互作用的结构域。CPNE蛋白与其目标蛋白相互作用可能与目标蛋白募集或调节目标蛋白的酶活性有关［10-11］。

CPNE1作为一种可溶性膜结合蛋白，可以通过C末端A结构域与不同细胞内蛋白质结合。进一步研究表明，该A结构域已在多种整合素和细胞外基质蛋白中进行研究，并可作为蛋白结合域［12］。C2结构域对钙和磷脂结合非常重要［13-14］。此外，多种蛋白质已被鉴定为Copine靶标，其中较多是参与细胞内信号通路的蛋白质，包括MEK1/ERK、蛋白磷酸酶5和CDC42调节蛋白激酶［15］。最近一项研究表明，在前列腺癌中CPNE 1表达高于正常前列腺组织，CPNE1过表达与前列腺癌患者分期及预后相关，且CPNE 1可以作为前列腺癌诊断的一个指标，进一步通过TCGA数据共表达分析发现CPNE1与TRAF2显著相关［16-17］。而在骨肉瘤中的研究显示，干扰CPNE 1可以抑制骨肉瘤Saos-2细胞的增殖和克隆，并对细胞凋亡有促进作用。干扰骨肉瘤中CPNE 1的表达使Saos-2细胞可以改变基因表达谱。改变的基因参与多种信号传导途径，包括MAPK途径，TGF-β通道等。此外，高群等［18］研究CPNE 1与细胞凋亡的关系，在体外缺氧/复氧诱导的H9c2细胞中，干扰CPNE 1基因后发现，干扰CPNE 1基因表达后同时下调C-caspase3蛋白表达，降低细胞凋亡率。通过敲减心肌细胞CPNE 1基因的表达，可以使凋亡相关Bcl-2蛋白表达上调、同时Bax蛋白表达出现下调，该研究结果表明CPNE 1能够抑制心肌H9c2细胞凋亡［18-19］。此外 C-caspase 3是Caspase 3的剪切体，也是细胞凋亡发生的分子标志物，参与多种细胞凋亡过程［20］。干扰CPNE 1基因表达后可能通过NF-κB活性增强抑制心肌细胞的凋亡发生，从而发挥心肌保护作用［21-22］。

CPNE 1在非小细胞肺癌中的作用尚不清楚。本资料结果显示，CPNE 1在腺癌中的表达高于正常肺组织，差异均有统计学意义（P<0.05），表明CPNE1在肺腺癌中可能起到促癌基因的作用。进一步分析CPNE 1蛋白表达与肺癌患者临床病理各参数的相关关系，分层分析发现CPNE 1基因表达水平与非小细胞肺癌患者性别、年龄、肿瘤大小无明显相关性（P>0.05），但在淋巴结转移患者组织中表达高于非淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P<0.05），提示CPNE 1基因表达水平可能与非小细胞肺癌患者预后有关。非小细胞肺癌中CPNE 1基因具有促癌作用，但其如何介导肺癌的发生发展目前尚未得知，需进一步研究。