基于网络药理学的侯氏黑散抗缺血性脑卒中机制研究

王 璇 马重阳 张雅文 程宏发 张秋霞

(首都医科大学中医药学院中医临床基础学学系 中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069)

脑卒中作为世界范围的三大疾病之一，具有高发病率、高致残率和高致死率的特点，给家庭和社会带来沉重的负担[1]。脑卒中属于中医“中风”的范畴，《金匮要略》首次设置“中风历节病脉证治第四”专篇论述中风病[2]。侯氏黑散为仲景治疗缺血性中风的“第一方”，体现了“补不足，损有余”的治疗法则[3]。目前，已有大量的临床研究[4-6]显示，侯氏黑散在缺血性脑卒中的预防及治疗中具有的显著疗效，而侯氏黑散的实验研究[7-10]聚焦的治疗靶点和信号通路主要集中在抗凋亡、调节炎性反应和促进血管新生等方面。网络药理学是整合了系统生物学、多向药理学、计算生物学、网络分析等多学科的技术和内容的一门新兴学科，基于“疾病-基因-靶标-药物”相互作用网络，从整体的角度去探索药物与疾病间的关联性，系统地观察药物对疾病网络的干预与影响。这与复方中药组方配伍的整体观相契合，反映了大数据时代复方中药系统性研究的新趋势[11-12]。本文将从侯氏黑散的药效成分和靶点的筛选展开，通过建立“成分-靶标-疾病-通路”网络，探究其治疗缺血性脑卒中的作用机制，为后续实验提供参考和依据。

1 资料与方法

1.1 研究思路

本实验关于侯氏黑散治疗缺血性脑卒中的网络药理学实验思路可概括为侯氏黑散活性成分、活性成分作用靶点、脑缺血靶点数据库建立，“成分-靶点-通路”网络建立与分析两部分，详见图1。

图1 侯氏黑散抗脑缺血的网络药理学研究思路Fig.1 Network pharmacology research processes of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeTCMSP: traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

1.2 数据库建立

1.2.1 侯氏黑散活性成分挖掘与筛选

中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)提供了中药成分中化合物的吸收、分布、代谢、排泄(absorption, distribution, metabolism, excretion, ADME)参数，通过设置口服吸收利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、血-脑脊液屏障(blood-brain barriers, BBB)≥-0.3和药物相似性(drug likeness, DL)≥0.18参数，筛选出侯氏黑散方中的主要活性成分。利用Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和Shemsrc数据库(https://www.chemsrc.com/en/)检索相关化学成分的CAS编号和分子式信息。

1.2.2 侯氏黑散活性成分作用靶点预测

TCMSP数据库检索侯氏黑散活性成分对应的靶点。利用Cytoscape 3.7.2软件[13]构建侯氏黑散活性成分-靶点作用网络并进行拓扑分析，在网络中，节点代表活性成分或靶点，边代表活性成分与靶基因间的相互作用关系，Degree值是每一个节点连接的边，一个节点与更多其他节点产生相互作用，这个节点的Degree值也就越高。因此Degree值能够反映节点在网络中的重要性，Degree值大的节点被认为是中心节点[11,14]。利用软件中的Network Analyzer工具计算Degree值来评价网络中成分和靶点的重要性。将不同来源的靶标输入UniProt数据库 (http://www. uniprot. org)中检索，限定物种为人，得到靶点对应的Gene Symbol，用于后续网络药理学分析。

1.2.3 缺血性脑卒中靶点挖掘

在OMIM(https://www.omim.org/)、Drug bank(http://www.drugbank.ca/)、GAD(http://geneticassociation-db.nih.gov/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)数据库中检索“cerebral ischemia/ischemic stroke”关键词，得到脑缺血相关靶点信息。

1.3 侯氏黑散抗缺血性脑卒中的“成分-靶点-通路”分析

1.3.1 成分-靶点网络构建

将活性成分靶点与疾病靶点的Gene Symbol信息导入Venny 2.1在线工具 (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图，交集部分认为是侯氏黑散抗缺血性脑卒中的关键靶点(药效靶点)。利用Cytoscape 3.7.2软件，构建侯氏黑散抗缺血性脑卒中成分-靶点相互作用网络，利用软件中的Network Analyzer工具计算Degree值来评价网络中成分和靶点的重要性。

1.3.2 蛋白相互作用网络构建

利用STRING数据库(https://string-db.org/)构建蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络，选择multiple proteins选项，将关键靶点的Gene Symbol信息导入，限定物种为人，获取蛋白相互作用关系，结果以.tsv文件格式导出。得到的.tsv文件导入Cytoscape软件，进一步绘制PPI网络图。利用软件中的Centiscape 2.2插件对网络中的蛋白进行中心性分析。将节点边的大小和颜色设置用于分别反映Degree值和Combine score值的大小，获得最终的蛋白相互作用网络图。

1.3.3 “靶点-功能-通路”网络构建

将交集靶点的Gene Symbol信息导入KOBAS在线服务器[15](http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1)，设定物种为人，进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析，得到侯氏黑散抗脑缺血的重要信号通路及相关参数，结果保存为.txt文件。利用Omicshare网站(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/seniorbubble)对相关KEGG信号通路进行可视化处理，按照网站提供的模版导入包含通路信息的文件，绘制KEGG结果的高级气泡图。利用KEGG Mapper工具(https://www.genome.jp/kegg/mapper.html)分析相关靶点在重要信号通路中的具体作用，得到侯氏黑散调控信号通路的模式图。

2 结果

2.1 侯氏黑散与缺血性脑卒中共同靶标确定

由于无法在TCMSP数据库中检索到牡蛎、矾石的相关信息，本文分析了侯氏黑散中其他十二味药物(菊花、白术、防风、桔梗、黄芩、细辛、干姜、人参、茯苓、当归、川芎、桂枝)的成分信息，筛选出了侯氏黑散方中的81个不重复活性成分，按照OB值大小排列，排名前20的有黄芩新素(neobaicalein)、苯代南蛇碱(celabenzine)、隐品碱(cryptopin)、二甲氧基黄酮(panicolin)、黄芩黄酮Ⅱ(skullcapflavone Ⅱ)等，具体成分信息详见表1。

表1 侯氏黑散OB值排名前20活性成分信息Tab.1 Informations of the top 20 active components in OB value of Houshiheisan

续表1

数据库检索得到活性成分的相关靶点112个，利用Cytoscape 3.7.2软件构建活性成分-靶点相互作用网络，得到了一个包含184个点和1 315条边的网络图(图2)。其中，Degree值排名前5的靶点有雌激素受体1(estrogen receptor, ESR1)、雄激素受体(androgen receptor, AR)、前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2)、二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4,DPP4)、一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase, inducible,NOS2)，它们的Degree值分别是63、61、49、47、44。

图2 侯氏黑散的活性成分-靶点网络Fig.2 Active component-target network of Houshiheisan

通过关键词检索Drug bank、OMIM、GAD、TTD 4个在线数据库，得到了316个缺血性脑卒中的相关靶点。韦恩图(图3)构建出活性成分-靶点和疾病-靶点的交集部分，共有22个交集靶点用于后续的网络药理学分析。

图3 侯氏黑散抗脑缺血靶点韦恩图Fig.3 Venn diagram of targets of Houshiheisan for treatment of ischemic stroke

2.2 侯氏黑散治疗脑卒中药效成分筛选

将得到的交集靶点作为药效靶点，利用Cytoscape 3.7.2构建药效靶点-成分相互作用网络(图4)。Degree值排名前10的药效靶点及相关信息详见表2。Degree值排名前5的药效成分分别为β-谷甾醇、隐品碱、原阿片碱、豆甾醇、山姜素，它们的Degree值分别是49、45、44、43、36。

图4 侯氏黑散抗脑缺血成分-药效靶点网络Fig.4 Active component-effective target network of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeESR1： estrogen receptor1； AR： androgen receptor； NR3C1： glucocorticoid receptor； PTGS2： prostaglandin G/H synthase 2； F2： prothrombin； NOS3：nitric oxide synthase, endothelial； F7： coagulation factor Ⅶ； KDR：vascular endothelial growth factor receptor 2.

表2 Degree值排名前10的侯氏黑散抗脑缺血靶点Tab.2 Top 10 anti-cerebral ischemia targets in degree value of Houshheisan

2.3 PPI网络分析

将侯氏黑散抗脑缺血的关键靶点输入STRING数据库分析，得到蛋白质相互作用网络。Cytoscape软件处理后，得到了一个有22个节点和82条连线构成的关联网(图5) 。图中的节点代表蛋白，边表示蛋白和蛋白间的关联，节点越大，颜色越深表示关联度越高。处于网络中心的靶点有血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)、肿瘤抑制蛋白(cellular tumor antigen p53, TP53)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、内皮型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase， endothelial,NOS3)、PTGS2等，他们的节点度分别为14、14、14、13、12、12。

图5 侯氏黑散抗脑缺血药效靶点的蛋白-蛋白相互作用网络Fig.5 Protein-protein interaction network of effective targets of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeVEGFA: vascular endothelial growth factor A; TP53: cellular tumor antigen p53; IL-6: interleukin-6; TNF: tumor necrosis factor;PTGS2: prostaglandin G/H synthase 2; NOS3: nitric oxide synthase, endothelial.

2.4 核心PPI网络的KEGG信号通路富集分析

利用KOBAS在线服务器和Omicshare 工具对22个关键靶点进行KEGG富集分析，得到侯氏黑散抗脑缺血的重要信号通路。按P值大小对排名前20的信号通路进行可视化处理(图6)，根据P值大小、富集因子大小和抗脑缺血相关性，认为重要的信号通路包括流体剪切应力通路、晚期糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体(advanced glycation end products/receptor for advanced glycation end products, AGE-RAGE)通路、缺氧诱导因子1-α/血管内皮生长因子(hypoxia inducible factor1-α/vascular endothelial growth factor, HIF1-α/VEGF)通路等。利用KEGG Mapper工具，分析侯氏黑散靶点在流体剪切应力通路、AGE-RAGE信号通路中的具体作用，得到侯氏黑散调控上述信号通路的模式图(图7、8)。

图6 侯氏黑散抗脑缺血药效靶点的KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of effective targets of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeKEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

图7 流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路Fig.7 Fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathwayNOS3： nitric oxide synthase, endothelial； TP53： cellular tumor antigen p53； AP-1： activator protein 1； TNF： tumor necrosis factor； VEGFA： vascular endothelial growth factor A； KDR： vascular endothelial growth factor receptor 2； BCL2： apoptosis regulator Bcl-2.

图8 晚期糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体信号通路Fig.8 Advanced glycation end products-advanced glycation end product receptor (AGEs-RAGE) signaling pathwayNOS3： nitric oxide synthase, endothelial；AP-1： activator protein 1； IL-6： interleukin-6； TNF： tumor necrosis factor； VEGFA： vascular endothelial growth factor A； BCL2： apoptosis regulator Bcl-2.

3 讨论

缺血性脑卒中占全部脑血管病患者的70%～80%，主要包括脑血栓形成和脑栓塞，脑组织缺血再灌注后的损伤与血流减少、能量代谢障碍、氧化应激、Ca2+超载、细胞凋亡等众多因素有密切关系[16-17]。缺血性脑卒中病理机制复杂多样，涉及大量信号通路网络的失调。医圣张仲景在《金匮要略·中风历节病篇》中记载“侯氏黑散治大风，四肢烦重，心中恶寒不足者”,“大风”指风邪直中脏腑，即中医学的“中风病”;“四肢烦重”即四肢沉重，活动不利而烦闷;“心中恶寒不足”点明了侯氏黑散治疗的中风类型是阳气不足为主要病机的证型[2,18]。侯氏黑散由人参、白术、茯苓、干姜、当归、川芎、防风、菊花、桂枝、桔梗、细辛、牡蛎、矾石十四味药组成，具有补益气血，祛风通络的功效。前期研究[7-10]结果显示，侯氏黑散具有抗细胞凋亡、调节炎性反应和保护神经血管等作用。为进一步探究侯氏黑散抗脑缺血的药效物质及作用靶点，笔者通过药效成分筛选、靶标预测、蛋白相互作用分析和KEGG富集分析得出了网络药理学相关结果。

利用TCMSP数据库以及Cytoscape构建药效靶点-成分相互作用网络，筛选出侯氏黑散抗缺血性脑卒中的5个主要药效成分为β-谷甾醇、隐品碱、原阿片碱、豆甾醇、山姜素[14，19-20]。β-谷甾醇是菊花、防风、干姜、黄芩、人参、当归、桂枝的共同成分；豆甾醇是人参、当归、黄芩的共同成分；隐品碱为细辛的成分； 山姜素为黄芩的成分；原阿片碱为人参的成分。其中，β-谷甾醇和豆甾醇是植物甾醇类成分[21]，均具有抗感染、抗氧化和改善神经功能的潜在作用[21-23]；隐品碱和原阿片碱为异喹啉生物碱一类化合物，能够作用于血管系统和神经系统，靶向PTGS2、凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ, F7)、血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2, KDR)起到抗感染、抗氧化、抗血小板聚集、保护血管等作用[24-25]；山姜素具有激动过氧化物酶体增殖物激活受体遏制炎性反应介质的合成，从而起到抑制炎性反应的作用[26]。

利用STRING数据库以及Cytoscape软件预测侯氏黑散抗脑缺血可能作用的靶点有ERS1、AR、PTGS2、凝血酶原(prothrombin, F2)、NOS3等。此外，Degree值排名前5的药效成分共同靶向ERS1、AR、PTGS2这些抗脑缺血靶点。中枢神经系统中的雌激素和雌激素受体能够通过核和非核作用参与运动协调、认知功能、突触可塑性、记忆和学习以及社会行为的调节过程，还可以通过减轻氧化应激和降低炎性反应因子(如肿瘤坏死因子等)表达发挥血管舒张和神经保护作用[27-28]。PTGS2又称环氧化酶2，是炎性反应因子的下游因子之一，在包括脑组织的人体各组织细胞中广泛表达，它的活性产物(如前列环素)参与了包括炎性反应、疼痛、内皮抗血栓的众多生理和病理过程中，能够参与介导脑缺血后的炎性反应[29]。

KEGG富集分析结果显示，流体剪切应力通路、AGE-RAGE通路、HIF1-α/VEGF通路等是侯氏黑散发挥抗脑缺血作用的排名靠前的信号通路。流体剪切应力是血管内因血流摩擦管壁产生的平行于血流方向的切线应力，对维持血管内皮结构和功能的完整性具有重要意义[30]。研究[30-31]证实，内皮细胞上的机械感应和信号转导是相互联系的，细胞膜上的很多生物分子(如整合素、酪氨酸激酶受体、G蛋白偶联受体等)都可以作为剪切应力改变的机械传感器。例如，血栓发生或动脉斑块形成时，血流方向受扰呈湍流状态，持续的低剪切应力下，激活子蛋白-1(activator protein 1, AP-1)和核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的激活，内皮细胞中促炎、促凋亡的基因和蛋白的表达上调，内皮功能受损，NOS3和KDR表达下调，炎性反应、氧化应激激活从而使血管新生受到抑制。AGEs是大分子物质糖基化形成的不可逆终末产物，其受体之一RAGE属于免疫球蛋白超家族[32]。在炎性反应、缺血再灌注损伤和缺氧等病理状态下，AGE-RAGE轴活化，一方面，转录因子NF-κB激活而AP-1受到抑制，刺激炎性反应因子和凝血因子激活导致炎性反应扩大，内皮细胞损伤加重，VEGF等促血管新生因子合成减少，血管新生受到抑制；另一方面，NF-κB表达增加又能上调RAGE，形成正反馈环[32-33]，使上述情况进一步加重。研究[8,10]显示，侯氏黑散能通过调节脑缺血大鼠大脑皮质VEGF/HIF-1α轴活性而发挥抗脑缺血的作用，这与分析结果相吻合。总之，侯氏黑散可能是通过对流体剪切应力、AGE-RAGE、HIF-1α/VEGF等通路能够联动地起到抗感染、抗氧化、抗凋亡作用，从而起到抗脑缺血损伤的作用。

结果显示，方中成分或作用于多个靶标、通路，或多个成分作用于同一个靶标、通路，这正体现了中药复方多成分、多靶标、多通路的复杂网状关系。调控通路涉及炎性反应、凋亡及血管新生等各个环节，各通路群间通过共有靶标连接，显示出不同成分间的多靶标协同作用。侯氏黑散的网络药理学结果初步验证了其抗脑缺血的相关机制，而这一结果尚需进一步实验数据的支持。