18F-硼氨酸细胞摄取机制研究

李 詝 李 囡 刘志博 杨 志*

(1. 北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所核医学科 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142； 2. 北京大学化学与分子工程学院，北京 100871)

氨基酸、糖类以及核酸是人类三大最基本的营养物质。正因如此，氨基酸转运载体(amino acid transporter, AAT)也成为人体内最为重要的营养物质与神经信号分子的转运体系之一[1]。多年的研究[2-3]表明，某些氨基酸转运体，如L型氨基酸转运体-1(large-neutral amino acid transporter-1,LAT-1)在恶性肿瘤细胞表面有着特异性的高表达，且它们的表达程度与肿瘤的恶性程度呈正相关。因此，通过无创性的PET影像对转运体的表达进行评测，对癌症的诊断有着重大的临床价值，同时也是发展新一代PET影像探针的重要途径[4-5]。

本研究所用的新型分子探针——F-18标记的苯丙硼氨酸(18F-BF3-Phe)是一系列全新的化合物——硼氨酸中的一种[6]。硼氨酸中的三氟化硼(-BF3)的引入，在基本不改变其体内活性的同时，一方面显著地提高了硼氨酸的生物稳定性，另一方面为F-18的标记带来了极大的便捷。相比于传统的放射性氨基酸的标记，生产步骤大大简化[7]。此外，细胞实验[8-9]证实，硼氨酸经由对应的氨基酸的转运载体进入细胞，并在特异性上和天然氨基酸相似。且既往的动物实验[10]证实：18F-BF3-Phe在活体内有良好的稳定性，而在肿瘤内有很高的特异性摄取，且在炎症中的摄取较低，与传统的氨基酸分子探针相比，优势明显。

本研究采用半自动方法对18F-BF3-Phe进行了标记，并完善了LAT-1转染细胞和多种肿瘤细胞放射性摄取实验，通过系统的细胞实验，建立18F-硼氨酸细胞摄取与LAT-1转运体表达的定量关系，初步阐述了18F-硼氨酸在癌细胞中的摄取机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

二氯甲基甲基醚、三氟甲磺酸甲酯、二异丙胺基锂、苯基硅烷、无水乙腈、四丁基氟化铵(北京化工厂)；Sep-pak C18柱(美国Waters公司)；Muhiscreem抽滤板(美国Millipore公司)；氟多功能模块(北京派特公司)；RM905型放射性活度仪(中国计量科学研究院)；FT-163γ井型计数器(北京核仪器厂)；pH测量计(意大利Hanna公司)；伽马计数仪(美国Packard公司)。

293T细胞、人肺腺癌PC9细胞、人胰腺导管细胞癌BXPC3细胞、人前列腺癌PC3细胞、人肝细胞癌HEPG2细胞(国家生物医学实验细胞资源库)；DMEM培养基、RPMI-1640培养基、0.25%(质量分数)胰酶、青霉素链霉素溶液(美国Hyclone公司)；Opti-MEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；Lipofectin试剂(美国Invitrogen公司)。

1.2 18F-BF3-Phe的放射性标记

BF3-Phe的化学合成参照Liu等[6]的文献报道完成。

放射性标记采用18F-19F同位素交换法(图1)，使用氟多功能模块进行标记反应。标记条件为：0.5 mg苯丙硼氨酸(BF3-Phe)，反应温度80 ℃，反应pH=2.0～2.5，反应时间10 min。反应结束后，反应混合物使用Sep-pak C18柱纯化，产物最终经Millipore无菌针头式过滤器除菌后使用。

图1 18F-19F同位素交换法标记苯丙硼氨酸Fig.1 18F-BF3-Phe is radio-synthesized via one-step 18F-19F isotope exchange

1.3 质量控制

1.3.1 化学纯度及放化纯度的检测

采用高效液相色谱法作化学纯度与放化纯度分析。液相系统由Waters515、Waters486紫外检测器和γ-RAM检测器构成。采用Waters C18色谱柱，检测波长262 nm，以乙腈∶醋酸/醋酸铵缓冲溶液(pH=4)=15∶85为流动相。

1.3.2 pH值的测定

标记反应pH值及终产物pH值由pH计测定。

1.3.3 安全性与异常毒性实验

18F-BF3-Phe溶液经Millipore无菌针头式过滤器除菌后送细菌室进行细菌培养。细菌内毒素实验采用鲎试验法，参照《中华人民共和国药典》(2015年版，四部)[11]规定的细菌内毒素检查法，依次完成鲎试剂灵敏度的复核、注射液的干扰实验和样品细菌内毒素的检查。

异常毒性实验：选取4～6周龄ICR小鼠5只，体质量为19～21 g，按正常饲养条件饲养。每只尾静脉注射18F-BF3-Phe注射液0.2 mL，剂量为37 MBq，其剂量相当于体质量为60 kg的人用剂量的300倍。注射前后称小鼠体质量，观察注射后48 h小鼠生存、饮食、活动及体质量变化及1周后生存情况。

1.4 LAT-1转染细胞摄取实验

1.4.1 细胞转染实验

提前24 h将用DMEM培养基[10%(体积分数)胎牛血清]培养的293T细胞消化后种植在12孔培养板上，细胞悬液浓度为5×105mL，每孔体积1.0 mL。批量配制人LAT-1基因质粒DNA稀释液，对于每孔细胞，使用50 μL Opti-MEM培养基稀释0.5 μgDNA。其中两孔使用插入mCherry序列的人LAT-1基因质粒DNA，使其同时表达荧光蛋白，用于在荧光显微镜下间接评估转染效率。批量配制Lipofectin试剂稀释液，对于每孔细胞，使用50 μL Opti-MEM培养基稀释1.5 μL Lipofectin试剂。Lipofectin 稀释后，在5 min内同稀释的DNA混合。混合稀释后的DNA和Lipofectin复合物在室温保温20 min。将提前铺好板的293T细胞换液后在培养箱中培养30 min，然后直接将复合物100 μL加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。加入复合物后的293T细胞置入37 ℃，5%(体积分数)CO2培养箱中培养24 h，在荧光显微镜下观察加有插入mCherry序列的人LAT-1基因质粒DNA的细胞孔，评估转染效率。

1.4.2 LAT-1转染细胞摄取实验

提前24 h将已转染人LAT-1基因质粒DNA的293T细胞及未转染的293T细胞，按照转染细胞占0%、20%、40%、60%、80%及100%的比例混合接种于24孔板，每种比例设置4个复孔，每孔体积0.5 mL，细胞数量为5×105mL，置入37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养24 h。从培养箱中取出细胞，小心吸掉培养基，每孔用1 mL事先预热(37 ℃)的磷酸盐缓冲溶液(PBS，包含0.9 mol/L Ca2+和1.05 mol/L Mg2+)清洗3次。每孔中加入0.5 mL PBS配制的18F-BF3-Phe 37kBq(1.0 μCi)，放入37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养。30 min后取出培养板，小心吸掉PBS，每孔用1 mL不含Ca2+和Mg2+的冷PBS清洗3次。每孔加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH收集细胞，将每孔中液体移入EP管中，使用伽马计数仪计量放射性计数。

1.5 多种肿瘤细胞摄取实验

提前24 h将PC9、 BXPC3、PC3、HEPG2细胞分别用0.25%(质量分数)胰酶消化，离心后去掉上清，用RPMI-1640培养基[10%(体积分数)胎牛血清]制成单个细胞悬液，细胞计数仪测定细胞数量为1×106mL，将各细胞株接种于24孔培养板上，每孔体积0.5 mL，置入37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养24 h。每种细胞株设置15、30、60 min 3个时间点，每个时间点设置4个复孔。从培养箱中取出细胞，小心吸掉培养基，每孔用1 mL 37 ℃预热的磷酸盐缓冲溶液(PBS，含0.9 mol/L Ca2+和1.05 mol/L Mg2+)清洗3次。每孔中加入0.5 mL PBS配制的18F-BF3-Phe 37 kBq(1.0 μCi)，放入37 ℃、5%(体积分数) CO2培养箱中培养。分别于15、30、60 min后取出培养板，小心吸掉PBS，每孔用1 mL不含Ca2+和Mg2+的冷PBS清洗3次。每孔加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH收集细胞，将每孔中液体移入EP管中，使用伽马计数仪计量放射性计数。

2 结果

2.1 标记及质控实验

BF3-Phe的模块化标记呈现良好的可重复性，标记产率可达到30%～40%，标记后的硼氨酸无须高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)纯化，稳定性好。HPLC质控结果可见，标记所得的硼氨酸有较高的放射化学纯度与化学纯度(图2)。标记后终产物pH值为中性7.0。细菌培养及细菌内毒素检查均为阴性。异常毒性实验小鼠活动正常，无死亡。18F-BF3-Phe注射液无菌、安全无毒性，符合医用放射性探针基本要求。

图2 标记后的苯丙硼氨酸具有很高的化学纯度和放射性纯度Fig.2 18F-BF3-Phe with high chemical purity and radiochemical purity was obtained

2.2 LAT-1转染细胞摄取实验

2.2.1 细胞转染实验

有两孔293T细胞使用了插入mCherry序列的人LAT-1基因质粒DNA进行转染，使其可同时表达mCherry荧光蛋白，这样转染成功的细胞会同时在细胞膜表达LAT-1及mCherry荧光蛋白，即在荧光显微镜下可见，可间接反映用人LAT-1基因质粒DNA进行转染的效率。转染插有mCherry序列的人LAT-1基因质粒DNA的293T细胞，培养24 h后在荧光显微镜下观察结果，转染效率约为40%～50%(图3)。

图3 转染插有mCherry序列的人LAT-1基因质粒DNA的293T细胞，培养24 h后在荧光显微镜下观察(40×)Fig.3 The fluorescent image of 293T cells transfected by human LAT-1 gene plasmid DNA inserted with mCherry sequence after 24 h culture LAT-1：large-neutral amino acid transporter-1.

2.2.2 LAT-1转染细胞摄取实验

加入37kBq18F-BF3-Phe培养30 min后，可见细胞的放射性摄取随着LAT-1转染细胞比例的增加而逐渐增加，基本呈线性关系(表1，图4)。

表1 各比例转染LAT-1的293T细胞摄取18F-BF3-Phe情况Tab.1 Uptake of 18F-BF3-Phe in LAT-1-293T with different transfection level

图4 18F-BF3-Phe摄取值与转染LAT-1的293T细胞的比例呈正相关Fig.4 The uptake of 18F-BF3-Phe was positively correlated with the proportion of LAT-1-293TLAT-1： large-neutral amino acid transporter-1; %AD： the percentage of cell uptake in total radioactivity.

2.3 多种肿瘤细胞摄取实验

如表2所示为不同肿瘤细胞分别在加入18F-BF3-Phe 15、30、60 min后的 %AD值，图5为相应的曲线图。可见18F-BF3-Phe在PC9、BXPC3、PC3、HEPG2 4种肿瘤细胞中均有摄取，并随时间推移呈逐渐增加趋势。其中PC9及BXPC3细胞对18F-BF3-Phe的摄取更为显著，随时间推移摄取明显增加。

表2 不同肿瘤细胞在加入18F-BF3-Phe 15、30、60 min后的%AD值Tab.2 The uptake of 18F-BF3-Phe in different cell lines after 15, 30 and 60 min 18F-BF3-Phe incubation %AD

图5 不同肿瘤细胞在不同时间点18F-BF3-Phe摄取值Fig.5 The uptake of 18F-BF3-Phe in various cell lines with different incubating time%AD： the percentage of cell uptake in total radioactivity.

3 讨论

本研究采用半自动方法对苯丙硼氨酸(18F-BF3-Phe)进行标记，相较于18F-FDG、11C-MET等传统的放射性分子探针，硼氨酸的放射性标记无须共沸干燥与HPLC纯化，一步即可完成标记，且标记产率较高、纯度好、比活度高，所生产的18F-BF3-Phe注射液无菌、安全、无毒性，较11C-MET等其他氨基酸放射性分子探针有明显优势，将更易于今后进行临床转化。

LAT-1是一种不依赖钠离子的氨基酸转运体。主要存在于脑、结肠、肺、肝脏、胸腺、卵巢、皮肤及肿瘤细胞中，跨细胞膜转运例如酪氨酸、苯丙氨酸这类大分子中性氨基酸。所有氨基酸均是亲水的，因此必须在选择性转运蛋白的帮助下才能通过细胞膜。大部分氨基酸转运体可以识别不止一种氨基酸。因为肿瘤细胞对氨基酸的需要量很大，其细胞表面的选择性氨基酸转运体的数量自然会上调以满足对氨基酸的需要。因此，LAT-1在多种肿瘤中高表达，包括恶性胶质细胞瘤、非小细胞肺癌等，其表达与肿瘤的增殖、血管生成及较差的预后密切相关。并且LAT-1随着肿瘤的进展表达相应增高，在高级别肿瘤及已有转移的肿瘤中均可见其表达更高。特别是，LAT-1在肿瘤相关的代谢网络中扮演重要角色，向肿瘤细胞生长提供必需氨基酸和一些促进增殖的信号分子，比如可以激活mTOR旁路的分子。并且，抑制LAT-1的功能可以减少肿瘤细胞的增殖，这使其可以成为一个新型的抗肿瘤治疗的可行靶点。基于LAT-1上述在肿瘤组织中高表达的特点，用放射性标记对应氨基酸进行PET显像即可明确LAT-1表达情况，进而进行肿瘤显像并了解其增殖、预后等情况。

硼氨酸拥有与天然氨基酸完全一致的侧链结构，它们是天然氨基酸的等电子体[6]。经细胞实验[6]证实，硼氨酸经由对应的氨基酸转运载体进入细胞，并在渠道选择性上和天然氨基酸基本一致。本研究中所用显像剂苯丙硼氨酸(18F-BF3-Phe)，即为一种苯丙氨酸类似物，通过LAT-1转运，可较特异性的被肿瘤摄取，并且不参与蛋白质代谢，是一种很有用的氨基酸显像剂。

LAT-1转染细胞摄取实验意在明确18F-BF3-Phe与LAT-1转运体表达的相关性，以证实其确实经LAT-1转运并可显示LAT-1的表达情况。在细胞转染实验中，有两孔293T细胞使用了插入mCherry序列的人LAT-1基因质粒DNA进行转染，使其可同时表达mCherry荧光蛋白，这样转染成功的细胞会同时在细胞膜表达LAT-1及mCherry荧光蛋白，即在荧光显微镜下可见，可间接反映用人LAT-1基因质粒DNA进行转染的效率。24 h后在荧光显微镜下观察插入mCherry序列的人LAT-1基因质粒DNA转染的效率约为40%～50%，可推测用人LAT-1基因质粒DNA进行转染的效率与之相似或高于插入mCherry序列的人LAT-1基因质粒DNA的转染效率(新插入多余的序列并不一定在原质粒DNA中均成功插入，可能使转染效率被低估)，因此293T细胞转染人LAT-1基因质粒DNA成功，其细胞膜表面高表达LAT-1，可用于后续细胞摄取实验。而在18F-BF3-Phe细胞摄取实验中，细胞所摄取的放射性随着LAT-1转染细胞的增多而增多，呈现出明显的18F-BF3-Phe摄取与LAT-1表达的正相关性。证实了18F-BF3-Phe同苯丙氨酸一样经LAT-1转运，并且可体现LAT-1的表达高低，这是后续一系列实验的基本理论依据，为后续的肿瘤细胞实验，以及未来的动物以及人体实验打下了良好的基础。

虽有研究[12]表明LAT-1在各种肿瘤细胞中高表达，但其在不同肿瘤细胞中高表达程度却也不尽相同，并且在同一种肿瘤中，由于不同的分化或分级程度以及是否转移等因素,LAT-1的表达会有所差异[13]。本研究选择了PC9(人肺腺癌细胞)、BXPC3(人胰腺导管细胞癌细胞)、PC3(人前列腺癌细胞)、HEPG2(人肝细胞癌细胞)4株人常见肿瘤细胞系进行肿瘤细胞摄取实验，以了解18F-BF3-Phe在不同肿瘤中的摄取情况。在加入18F-BF3-Phe15、30、60 min后，可见PC9、BXPC3、PC3、HEPG2 4种肿瘤细胞中均有放射性摄取，并且随时间推移均呈逐渐增加趋势。其中PC9及BXPC3细胞对18F-BF3-Phe的摄取更为显著，随时间推移摄取明显增加。虽然这4株细胞只是肺腺癌、胰腺癌、前列腺癌及肝细胞癌的一个细胞株，但也还是具有一定的代表性，根据这个细胞摄取结果可以预测18F-BF3-Phe在肺癌及胰腺癌显像中会有更好的效果，未来的动物实验可选择PC9及BXPC3细胞建立肿瘤动物模型。另外，根据既往研究[6]结果，18F-BF3-Phe在人胶质瘤细胞株U87MG中亦有较高摄取，适于进行肿瘤动物模型显像。并可以推测在人体内相关肿瘤也会有较好显像效果，为未来的临床转化提供了理论基础。

结论:1)本研究首先对新型分子探针18F-BF3-Phe进行了模块化成功标记，方法简便高效。通过LAT-1转染细胞摄取实验显示18F-BF3-Phe摄取与LAT-1转运体表达之间呈正相关，明确了18F-BF3-Phe经由LAT-1进入细胞的摄取机制，为进一步的体内实验提供了重要的理论基础。2)多种肿瘤细胞摄取实验显示18F-BF3-Phe在多种肿瘤细胞中均有高摄取，显示该探针在肿瘤显像方面进行临床转化的良好前景。