高淀粉水平下精氨酸对松浦镜鲤肠道形态与功能的影响

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

鱼类的糖类物质利用率是三大营养物质中最低的。鱼类饲料中添加适宜水平的糖类物质可以降低饲料中蛋白质的用量，促进ATP的形成，活化氨基酸，增加鱼体自身蛋白质的合成。更重要的是，饲料中糖类物质的添加可以大幅度降低养殖成本，降低水产养殖对鱼粉、鱼油等紧缺资源的依赖，同时减少饲料中氮、磷的排放对水体的污染，促进水产养殖产业的可持续发展。但是，饲料中糖水平超过一定限度会引发鱼类抗病力低、生长迟缓、高死亡率等现象。李晋南等[1]研究了不同糖及糖水平对松浦镜鲤（Cyprinus carpioL.）肠道消化酶和肠道形态的影响，发现高淀粉可以增加肠道消化酶活性，同时对肠道形态未产生影响。

精氨酸（Arginine，Arg）作为一种条件性必需氨基酸，不仅是机体蛋白质的组成成分，而且是一氧化氮（NO）、尿素、多胺、肌酸等活性物质的前体，在促进蛋白质合成、增强机体的免疫力、激素分泌和繁殖等各种生理过程中起着重要作用。目前研究表明，在鱼类糖代谢调控中，葡萄糖并非是诱导胰腺分泌胰岛素的最有效应因子，精氨酸或其他氨基酸具有比葡萄糖更高的促胰岛素分泌能力[2-3]。在糖尿病患者的临床实验中发现，精氨酸可以促进糖吸收，增加胰岛素的分泌，提高胰岛素的敏感性，从而影响机体的糖代谢[4-5]，Paolisso等[6]研究表明L-精氨酸可以通过胰岛素调节葡萄糖吸收，而D-精氨酸没有这个功能。但目前关于精氨酸调节鱼类糖代谢的研究尚未见报道。

松浦镜鲤是中国水产科学研究院黑龙江水产研究所在德国镜鲤选育系(F4)的基础上选育的新品种，具有很高的经济价值。松浦镜鲤作为杂食性鱼类，对糖类物质的利用能力较强，Wilson[7]的研究表明鲤鱼利用淀粉的能力优于葡萄糖，并且能耐受400 g/kg 的糖类物质；Li 等[8]研究表明，松浦镜鲤可以耐受50%高淀粉饲料。本研究以松浦镜鲤为研究对象，研究高淀粉水平下添加精氨酸对松浦镜鲤肠道消化酶活性及肠道形态结构的影响，以期为高糖饲料的利用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

L-精氨酸购自Sigma，纯度≥98.5%。

1.2 实验动物及日粮

松浦镜鲤选自中国水产科学院黑龙江水产研究所呼兰实验站。实验饲料以酪蛋白和鱼粉作为蛋白质源，鱼油和豆油作为脂肪源，淀粉作为糖源，配制成5 组等氮等脂的实验饲料，在45%水平的高淀粉饲料中分别添加质量分数0%、0.6%、1.2%、1.8%、2.4%的精氨酸，其组成及营养水平见表1。饲料原料经粉碎过筛后，按饲料配比准确称量后混合均匀，采用逐级扩大法混合少量的组分，然后用颗粒机制成1.5 mm 颗粒饲料，自然风干后，置于-20 ℃冰箱中保存待用。

表1 基础饲料配方及营养组成（干物质质量分数）Table 1 Ingredients and approximate composition in the basal diets (air-dry basis) %

1.3 实验设计与管理

实验选择规格一致的健康松浦镜鲤预饲2 周后随机分组，初始体质量为（6.84±0.02）g 的松浦镜鲤360 尾随机分为5 组，每组设4 个重复，每个重复18 尾鱼，分别为高淀粉饲料中添加0%Arg 组（A0）、0.6%Arg 组（A0.6）1.2%Arg 组（A1.2）、1.8%Arg 组（A1.8），以及2.4%Arg 组（A2.4）。养殖周期8 周，每天定时投喂3 次，每次投喂以饱食无残饵为准。实验在室内控温循环水玻璃缸中进行（200 L），24 h 不间断供氧，整个实验光周期为12 L/12 D，溶氧大于5 mg/L，氨氮小于0.02 mg/L，温度为（23±1）℃，pH 值为7.15±0.05。每日吸污，每周换去水族箱内1/3 水并注入已曝气的水，每日观察记录鱼摄食和死亡情况。

1.4 肠道消化酶的测定

养殖实验结束后，停饲12 h[9]，每缸随机取3尾鱼，用MS-222(0.5 mg/L)麻醉后，测量体质量和体长后，置于冰盘中迅速解剖，取肠道用预冷的质量分数0.86%生理盐水清洗肠道中的内容物，滤纸吸干水分，测量肠质量和肠长。将肠道分为前肠、中肠和后肠，分别按1∶9 质量体积比加入预冷的生理盐水，以FJ-200CL 高速组织匀浆机匀浆，将匀浆液在4 ℃条件下离心10 min（4 000 r/min），取上清液分装于1.5 mL 离心管中，保存于-20 ℃冰箱中，待测前中后肠的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。

蛋白酶活性测定采用福林-酚（Folin-phenol）法，淀粉酶和脂肪酶活性采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定，具体方法参见试剂盒说明书。组织蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[10]。

1.5 肠道形态的测定

制备肠道组织切片：饲养实验结束后，每组随机取3 尾鱼，用MS-222(0.5mg/L)麻醉后，置于冰盘中迅速解剖，分别取1 cm 的前肠、中肠和后肠组织段，去除肠道内容物，用生理盐水（0.86%）冲洗干净后，固定于Bouin 氏液中。固定24 h 后，经过乙醇逐级脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（5 μm）、HE 染色、脱水、透明、中性树脂封片。制成组织切片，用Leica MD 4000B 显微镜进行观察并拍照，Motic Images Plus 2.0 软件对图像进行测量，每段肠样测量10 个以上完整皱襞高度、绒毛宽度和肌层厚度，取其平均值作为该样品皱襞高度、绒毛宽度和肌层厚度的测定结果。

肠道指标计算：根据实验鱼体质量、体长、肠质量和肠长，计算肠体指数（Intestinal somatic index，ISI）和肠长指数（Intestinal length index，ILI）。

肠体指数（ISI）=肠质量/体质量；

肠长指数（ILI）=肠道长/体长。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 高淀粉饲料中添加Arg 对松浦镜鲤肠道消化酶的影响

高淀粉饲料中添加Arg 后比较松浦镜鲤前肠、中肠和后肠的淀粉酶活性，各组之间没有显著差异(P＞0.05)；添加2.4%精氨酸组的前肠脂肪酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，中肠和后肠的脂肪酶活性各组间没有显著差异(P＞0.05)；前、中、后肠蛋白酶活性随精氨酸的添加而增加，添加1.8%和2.4%精氨酸组的前肠和中肠蛋白酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，添加2.4%精氨酸组的后肠蛋白酶活性显著高于对照组(P＜0.05)（图1）。

2.2 高淀粉饲料中添加Arg 对松浦镜鲤肠道形态的影响

由表2 可见，高淀粉饲料中添加Arg 显著影响了肠道的皱襞高度，但对肠绒毛宽度和肌层厚度没有显著影响。A2.4 组前肠皱襞高度显著高于其他各组(P＜0.05)，A1.8 组中肠和后肠皱襞高度显著高于A0 组(P＜0.05)，与其他各组间差异不显著(P＞0.05)。A1.2、A1.8 和A2.4 组的肠体指数显著高于A0 组(P＜0.05)，A2.4 组的肠长指数显著高于A0组(P＜0.05)。

图1 高糖饲料中添加Arg 对松浦镜鲤肠道消化酶活性影响Fig.1 Effects of Arginine supplementation in high starch diets on intestinal digestive enzyme activities of Songpu mirror carp

表2 高淀粉饲料中添加Arg 对松浦镜鲤肠道形态的影响Table 2 Effects of Arg supplementation in high starch diets on the intestinal morphology of Songpu mirror carp

2.3 肠道组织切片观察

各实验组前肠组织切片如图2 所示，各实验组的前肠肠绒毛均发育良好，绒毛密度没有显著差异。

图2 松浦镜鲤前肠组织切片Fig.2 Tissue slice of foregut of songpu mirror carp

各实验组中肠组织切片如图3 所示。各组中肠的肠绒毛均发育较好，排列整齐紧密，各组间没有显著差异。

图3 松浦镜鲤中肠组织切片Fig.3 Tissue slice of midgut of songpu mirror carp

各实验组后肠组织切片如图4 所示。各实验组后肠的肠绒毛均发育较好，排列较为紧密，各组间没有显著差异。

图4 松浦镜鲤后肠组织切片Fig.4 Tissue slice of hindgut of songpu mirror carp

3 讨论

鱼类对饲料糖的利用率较低，饲料中添加过量的糖类物质会影响鱼类的生长性能。目前，关于不同糖及糖水平对鱼类肠道健康的影响已有报道[11-12]，但是尚未见高糖饲料中添加精氨酸对肠道健康影响的报道。精氨酸是鱼类所需的10种必需氨基酸之一[13]，在鱼类营养代谢及免疫系统中发挥着重要调节作用[14-16]。有研究[2-3]表明，在鱼类中，精氨酸具有更高促胰岛素分泌能力，从而影响鱼类的糖代谢，进而提高鱼类对糖类物质的利用率。因此，本研究通过探讨高淀粉水平下精氨酸对鲤鱼肠道健康的影响，可为提高鱼类对饲料糖的利用率奠定基础。鲤鱼是无胃鱼，营养物质消化和吸收的重要场所就是肠道，肠道中消化酶的活性是衡量其对营养物质消化和吸收能力的重要指标[17]。淀粉酶的活性和分泌量影响着鱼类对饲料中糖类物质的消化吸收能力[18]，已有研究证明提高饲料中糖水平可以提高淀粉酶活性[19-20]，也有研究表明淀粉酶活性主要由遗传因素决定[21]。本实验室前期研究显示饲料中添加淀粉可以显著提高肠道淀粉酶活性[1]。王际英等[22]对仿刺参（Apostichopus japonicus）的研究表明，饲料精氨酸水平可以显著影响仿刺参肠道蛋白酶的活性，对脂肪酶和淀粉酶活性无显著影响。王连生等[23]对杂交鲟（Acipenser schrrenckii ♀×A.baeri ♂）的研究表明，饲料中添加精氨酸显著提高其前肠蛋白酶和淀粉酶活性。饲料中精氨酸水平可以显著提高建鲤蛋白酶和脂肪酶活性，但对淀粉酶活性无显著影响[24]。在黄颡鱼（Pelteobagrusfulvidraco）幼鱼的研究[25]中表明，饲料中添加适宜水平的精氨酸显著提高了其胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性及肝脏淀粉酶活性。本实验研究结果显示，高糖饲料中精氨酸对肠道淀粉酶活性没有显著影响，其可能原因是高淀粉饲料已经显著提高了淀粉酶活性，因此添加精氨酸后对淀粉酶活性没有显著影响。但饲料中添加精氨酸显著提高了前肠脂肪酶和前、中、后肠的蛋白酶活性，这一结果说明高淀粉饲料中添加精氨酸，可以显著改善肠道消化酶活性，提高其营养物质的吸收和利用。

除了肠道消化酶活性是影响鱼类消化吸收能力的重要指标，肠道发育同样是影响鱼类对营养物质消化吸收的重要因素[26]，其中肠道皱襞的高度、密度及排列状态等均可影响鱼类肠道消化吸收能力[27-28]。Cheng等[29]研究表明，添加1%精氨酸可以提高美国红鱼（Sciaenops ocellatus）前肠和中肠皱襞高度和前肠的上皮细胞高度，添加1%～ 2%精氨酸可以提高杂交条纹鲈（Morone chrysops×Morone saxatilis）肠道绒毛高度、肠上皮细胞高度和微绒毛高度[30]。在杂交鲟幼鱼的研究[24]中表明，饲料中添加适宜水平的精氨酸能显著提高其前肠和中肠的皱襞高度，以及前肠肌层厚度。陈思琦等[31]研究表明，随精氨酸添加水平的升高，斜带石斑鱼（Epinephelus malabaricus）前中后肠的肌层厚度、皱襞高度均升高。本实验研究表明，高淀粉饲料中添加适宜水平的精氨酸可以显著增加松浦镜鲤前中后肠的皱襞高度，说明适宜水平的精氨酸可以改善肠道结构来提高肠道对营养物质的消化吸收能力。此外，哺乳动物的研究中表明，精氨酸可以增加肠道质量[32-33],本实验的结果同样显示，高淀粉饲料中添加适宜水平的精氨酸显著增加了肠体指数和肠长指数，这一结果说明精氨酸可以通过促进肠道发育来提高肠道对营养物质的吸收能力。

综上，在高淀粉饲料中添加1.8%～ 2.4%精氨酸可以显著提高松浦镜鲤肠道消化酶活性，改善肠道结构，促进肠道发育，从而提高肠道对营养物质的消化吸收能力。