不同附着基质对长茎葡萄蕨藻生长及附着效果的影响

2021-02-03

广东海洋大学学报 2021年1期

（广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088；广东省藻类养殖及应用工程技术中心，广东湛江 524025）

长茎葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）隶属蕨藻科（Caulerpaceae），蕨藻属（Caulerpa），俗称“海葡萄”，又名“绿色鱼子酱”，是一种富含矿物质、不饱和脂肪酸、蛋白质、膳食纤维的食用绿藻[1-3]，其在治疗糖尿病、肥胖症、增强免疫力和抗炎症等方面显示出广泛的医药应用前景[4-5]。长茎葡萄蕨藻还能富集人体所需微量元素如铁、锌、硒等，可用于保健品和功能性食品的开发[6-7]。

长茎葡萄蕨藻为固着型海藻，通过假根附着于沙地、珊瑚礁等区域。目前，长茎葡萄蕨藻一般采用陆基室内工厂化水池（箱）的养殖方式，附着基质通常为采用塑料网和尼龙绳网等，利用网片夹住藻体使其附着生长[8]，而在开放水域养殖藻体，则利用网笼、泥土、砂砾等作为附着基质，Tanduyan等[9]发现长茎葡萄蕨藻在砂砾底质、中层水位海域用塑料网笼养殖时产量最高。Pariyawathee 等[10]报道长茎葡萄蕨藻在泥质附着基质上生长更好，Rabia等[11]发现长茎葡萄蕨藻在池底播种养殖首月增重比托盘吊养高444%。相关研究发现不同的附着基质会导致藻体营养成分的变化，如Long 等[12]发现砂砾底质养殖长茎葡萄蕨藻会导致其灰分、碳水化合物含量上升，Perryman 等[13]发现酸性土壤会导致蕨藻重金属含量上升。由此可见，前人的研究更多集中在附着基质等环境因子对藻体总产量的影响，而关于不同附着基质对长茎葡萄蕨藻具有食用价值的直立枝生物学特性的影响以及附着效果比较的研究鲜有报道。因此，本实验以垂直砂埋、水平砂埋、塑料网网夹、尼龙网网夹及无附着基质（对照组）等五种附着方式，研究不同附着基质对长茎葡萄蕨藻生长、附着效果和营养组分的影响，以期为长茎葡萄蕨藻增产和品质提升奠定基础。

1 材料与方法

1.1 前期处理

藻种：长茎葡萄蕨藻从深圳市蓝汀鼎执生物科技有限公司购买，培养于广东海洋大学水产学院藻类实验室。

暂养条件：温度（25±1）℃，照度（4 000±100）lx，光暗周期12 L∶12 D，额外添加营养盐（N，0.5 mmol/L NaNO3溶液；P，0.01 mmol/L KH2PO4溶液），海水盐度30±1，pH 为8.1，连续充气培养，换水周期为2 d[14]。

1.2 附着基质

实验选用附着基质为塑料网、尼龙绳网和海砂，海砂采于广东省湛江市硇洲岛沙滩，经海水清洗和灭菌锅高温灭菌后，烘干待用。长茎葡萄蕨藻的附着基质与种植方式如图1 所示。

1.3 实验设计

实验前，将整株藻体剪至2～3 cm，放入的灭菌海水中暂养1 d。采用 1.5 L 塑料盒作为培养容器，添加1 L 灭菌海水，设计A、B、C、D、E 组，A 组为藻体垂直砂埋于砂砾，B 组为藻体水平砂埋于砂砾，C 组藻体以两层塑料网网夹并置于容器底部，D 组藻体以两层尼龙网网夹并置于容器底部，对照组E 为无附着基质培养。选取健康藻体，随机分布至各组，每组5 株，每组设置3 个平行组，每天都添加1 mL 培养液（N，0.5 mmol/L NaNO3溶液；P，0.01 mmol/L KH2PO4溶液），换水周期3 d，光照度为（2000±100） lx，其余培养条件同1.1，每天观察，15 d 后结束实验。

培养前测量藻体初始质量m0（各组藻体的初始质量无显著差异），初始直立枝长度LZ0及匍匐茎长度LP0，最大光能转化效率（Fv/Fm）及实际光化学效率Y（II）。

1.4 指标的测定

1.4.1 藻体生长指标测定实验结束后，取出藻体用无菌海水冲洗，用吸水纸吸干藻体表面水分，用游标卡尺测量新生直立枝长度LZ、匍匐茎长度LP及新生球状小枝直径d，天平秤称取实验末藻体总质量、新生直立枝质量及新生匍匐茎质量分别为m15、mZ、mP，计算藻体特定生长率（SGR）及新生直立枝质量长度比（R）[15]。

1.4.2 附着能力指标测定实验结束后，取出藻体用无菌海水冲洗干净，计算假根数量和长度。将五组藻体的假根部分重新埋入海砂中，3 d 后取出，用毛刷刷下假根附着砂粒，在烘箱烘干后计算砂砾质量m[16]。

1.4.3 叶绿素荧光参数在实验开始后6 h、1 d（24 h）、3 d（96 h）、7 d（168 h）、15 d（360 h）分别取出藻体进行暗处理10 min，用叶片夹固定直立枝在叶绿素荧光仪（PAM-2500）下测量叶绿色荧光参数，包括Fv/Fm、Y（II）[14,17]，重复3 次（包括暗处理），取平均值。

1.4.4 营养指标将藻体进行剪切，匀浆，稀释，按照南京建成试剂盒说明书测量指标，分别测其可溶性糖和总蛋白含量。

1.5 计算公式

SGR=ln（m15/m0）/t，

式中m0为初始质量（g），m15为最终质量（g）。

长茎葡萄蕨藻直立枝的球状小枝密度与直径大小、质量长度比值是衡量该食品品质的重要标准之一[15,18]，因此，测量新生直立枝质量长度比（R，g/mm）作为商品品质的评价指标：

R=mZ/LZ，

式中mZ为新生直立枝质量（g），LZ为新生直立枝长度（mm）。

总蛋白质量浓度（g/L）=（待测D值-空白D值）/（标准D值-空白D值）×标准品质量浓度（0.524 g/L）×稀释倍数，在λ=595 nm 处测量。

可溶性糖质量浓度（mg/mL）=（待测D值-空白D值）/（标准D值-空白D值）×标准品质量浓度（100 μg/mL）×稀释倍数/待测样本蛋白浓度，在λ=620 nm 处测量。

1.6 数据处理

实验数据采用SPSS 23 进行分析，以平均值±标准误表示，并作单因素方差分析和Duncan 多重比较，P＜0.05 时差异有统计学意义，用GraphPad Prim7 作图，比较结果的显著与否判断仅限于统计意义范畴。

2 结果与分析

2.1 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻生长的影响

各组长茎葡萄蕨藻培养2 d，从其断口处均长出白色丝状组织，参照以往资料可判断出该组织为藻体假根[16]；4 d，A 组在原有的直立枝侧面或末端长出新直立枝，其新生匍匐茎在原直立枝下端生长，B 组新生直立枝从原匍匐茎上生长，其余组在匍匐茎断口有新生匍匐茎出现；7 d，除A、B 组外，其余组仍无新生直立枝，C、D 组的匍匐茎分支数最多；15 d，A、B 两组新生直立枝数与其他各组相比显著增多（P＜0.05），其中A 组新生直立枝长度最长，而C、D 组新生匍匐茎数显著增多（P＜0.05）。长茎葡萄蕨藻培养15 d，A 组的新生直立枝数与新生直立枝质量最优，与其余组相比有显著提高（P＜0.05），其新生直立枝数为3.00，质量为0.313 3 g，最大长度为41.11 mm，新生球状小枝直径为1.67 mm。C 组的新生匍匐茎数和长度与其他各组相比有显著提高（P＜0.05），其新生匍匐茎数为8.75，新生匍匐茎质量为0.210 2 g，新生匍匐茎长度为100.05 mm（图2、表1）。

长茎葡萄蕨藻特定生长率，如图（3-Ⅰ），A 组长茎葡萄蕨藻特定生长率最高，为4.576 3 %·d-1，明显高于其余组（P＜0.05），其余各组之间无明显差异（P＞0.05）；新生直立枝质量长度比如图（3-Ⅱ）所示，A 组最高，为0.085 6 g/mm，与对照组E 相比有显著差异（P＜0.05），是E 组的8.92 倍。

可见，垂直砂埋组藻体的生长最好，垂直砂埋对藻体新生直立枝的质量、长度及球状小枝直径有显著影响，而网夹组对藻体新生匍匐茎的长度及分支有显著影响。

图1 附着基质类型与种植方式Fig.1 Types of substrates and planting methods

图2 不同附着基质下长茎葡萄蕨藻培养15 d 的生长情况Fig.2 Effect of different substrates on growth of Caulerpa lentillifera after 15 day

表1 不同附着基质下长茎葡萄蕨藻再生生长情况Table 1 Effect of different substrates on growth of Caulerpa lentillifera after 15 day

图3 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻生长的影响Fig.3 Effect of different substrates on growth of Caulerpa lentillifera

2.2 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻附着效果影响

实验结束后，不同附着基质对藻体附着效果，如图4 所示。B 组假根长度最长，均值为30.25 mm，明显高于E 组（P＜0.05），A、C、D、E 组各组间无显著差异（P＞0.05）（图4-Ⅰ）；A 组假根数最多，为32 根，显著高于假根为9 根的E 组（P＜0.05），其余组间无显著差异（P＞0.05）(图4-Ⅱ)；B 组假根附着砂砾质量最高，为0.556 0 g，E 组为0.160 0 g，明显高于E 组（P＜0.05），B 组是E 组的3.48 倍，其余组与E 组无显著性差异（P＞0.05）（图4-Ⅲ）。

由此可见，水平砂埋对藻体的假根长度、假根数及假根附着砂砾干物质质量有显著影响。

2.3 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻Fv/Fm 和实际光转化效率Y（II）影响

不同附着基质对长茎葡萄蕨藻Fv/Fm的影响，如图5 所示。各组在6 h 显著下降，A 组Fv/Fm值最高，明显高于E 组（P＜0.05）；24 h，A 组最大，为0.855 μmol·m-2·s-1，是E 组的1.1 倍，其余组与E组无明显差异（P＞0.05）；15 d，A、B、C、D 均恢复原有水平，其组间无明显差异（P＞0.05），都明显高于E 组（P＜0.05）。

图4 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻附着效果的影响Fig.4 Effect of different substrates on attachment effect of Caulerpa lentillifera

图5 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻Fv/Fm 的影响Fig.5 Effect of different substrates on Fv/Fm of Caulerpa lentillifera

不同附着基质对长茎葡萄蕨藻Y（II）的影响，如图6 所示。在6 h，各组显著下降，各组无显著差异（P＞0.05）；24 h，A 组最高，为0.851 μmol·m-2·s-1，明显高于E 组的0.777 μmol·m-2·s-1（P＜0.05），其余组无显著差异（P＞0.05）；7 d，除E组外，各组无明显差异（P＞0.05），均恢复到初始状态；15 d，A、B、C、D 组均与E 组有显著差异（P＜0.05）。

可见，A 组与其余组相比，其Fv/Fm和Y(II) 值恢复最快，比较Fv/Fm值恢复快慢，其数值顺序为：A＞B＞D＞C＞E，而E 组低于原始水平。

图6 不同附着基对长茎葡萄蕨藻Y（II）的影响Fig.6 Effect of different substrates on Y(II) of Caulerpa lentillifera

2.4 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻营养积累影响

不同附着基质对长茎葡萄蕨藻可溶性糖含量的影响，如图7 所示。

图7 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻可溶性糖含量的影响Fig.7 Effect of different substrates on content of soluble sugar of Caulerpa lentillifera

A、B 组可溶性糖含量与对照组相比有显著降低（P＜0.05），其余各组间无显著差异（P＞0.05），藻体可溶性糖含量E 组最高，为147.2 mg/mL。

不同附着基质对长茎葡萄蕨藻蛋白质浓度的影响如图8。A 组总蛋白含量显著高于E 组（P＜0.05），为30.00 g/L，是E 组（23.80 g/L）的1.26倍，其余各组无显著差异（P＞0.05）。由此可见，砂埋处理的藻体会导致其可溶性糖含量显著下降，而垂直砂埋处理的藻体其蛋白质含量明显上升。

图8 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻蛋白质浓度含量影响Fig.8 Effect of different substrates on content of total Protein of Caulerpa lentillifera

3 讨论

3.1 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻生长的影响

附着基质是影响海藻生长发育的主要生态因子之一，能影响海藻根茎生长、物种迁移、生殖发育等[19-21]。海藻附着基质的研究一直备受关注。在育苗方面，成熟的海带（Saccharina japonica）是以育苗帘收集其游孢子并栽培[22]，坛紫菜（Pyropia haitanensis）是以贝壳为附着基质附着丝状体[23]，而长茎葡萄蕨藻的栽培主要以网、绳子、网笼或砂砾充当附着基质进行栽培[24]。在长茎葡萄蕨藻附着基质研究中，谭围等[25]用双面网栽培海葡萄比底播方式生长更好，Rabia 等[11]发现采用底播方式，海葡萄产量比托盘吊养高444%，Tanduyan 等[9]用塑料网笼与砂砾栽培海葡萄3 个月增重413.3 g。关于其他海藻附着基质的研究中，Voerman 等[26]发现海藻在砂砾附着基质上栽培其叶片更长，鼠尾藻（Sargassum thunbergii）在水泥块培育期幼苗显著增长[27]。

长茎葡萄蕨藻的直立枝为可食用部分，其新生直立枝质量、质量长度比、球状小枝直径等是评判长茎葡萄蕨藻品质的标准，指标越高恰好说明藻体生长良好，产量高，品质优良。本实验条件下，藻体在垂直砂埋处理下其新生直立枝长度和数目均显著增加，其新生直立枝的质量和质量长度比值最大，对比塑料网、尼龙网栽培的藻体，新生直立枝质量增幅633.73%和464.50%，新生直立枝质量长度比增幅205.71%和235.68%，说明砂砾附着基质能提高直立枝的产量，垂直砂埋更符合藻体形态学生长特性，且砂砾附着基质更接近蕨藻自然海域的生长环境[28-29]；另外，塑料网、尼龙网栽培的藻体新生匍匐茎长度和分枝数值显著增高，原因可能是栽培网一定程度遮蔽光照，低光照能促进匍匐茎生长，这与吴启藩[15]的研究成果一致。可见，对比网夹栽培，垂直砂埋更能促进长茎葡萄蕨藻直立枝的生长。

3.2 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻附着效果影响

蕨藻的假根为丝状假根，用于固着附着基质。羽状蕨藻（Caulerpa mexicana）[30]和育枝蕨藻（Caulerpa prolifera）[31]的假根会分泌一种植物蛋白帮助藻体附着。假根的生长会直接影响海藻的成活率及产量[32]，若根不够多、长，则附着不牢固，会造成脱苗、死苗等现象[33]。所以增殖根茎对海藻栽培有直接必要性。大型海藻可通过组织切割诱导假根生长[34-35]，Duarte 等[36-37]发现以砂埋方式栽培的丝粉藻（Cymodocea nodosa）生长更快，叶片、根茎的长度等指标均上升；蕨藻在低氮磷、低光照、砂砾底质等条件会促进假根生长，同时藻体叶片生长率会随着假根的生长而提高[16]。

假根的数量和长度与附着砂粒质量呈正相关，假根附着砂砾干质量是测试假根附着力的重要标准之一[16]。本实验中水平砂埋的藻体假根数和假根长度显著性增加，其假根长度超过3 cm，是其他附着基质藻体的3 倍，可能是因为砂埋的方式使假根处于低光或无光的环境，营养盐吸收量不及直接暴露在海水中的多[20]，对比网附着基，砂砾附着基为假根提供更大附着面积及粗糙附着面[30,38]，促进藻体生长出更多、更长的假根，从而增强其附着力；实验中水平砂埋藻体假根附着砂砾质量明显重于其余处理组，对比网夹栽培的藻体，增幅152.89%和155.56%，进一步证实海葡萄水平砂埋处理后，其附着效果最佳，其次为垂直砂埋。

3.3 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻Fv/Fm 和实际光转化效率Y（II）的影响

叶绿素荧光是探讨光合作用的指标，其中Fv/Fm和Y（II）表示光系统II（PSII）最大光化学量子产量[39]，在海藻的研究中，叶绿素荧光参数可反映环境因子对海藻产生胁迫程度[40]。如杉叶蕨藻（Caulerpa taxifolia）以纱网为附着基质，其Fv/Fm值会降低[41]，水流过缓、群体密度增大会影响海藻光合作用[42]，海藻在适宜条件下该参数几乎没有波动，但在受到胁迫情况下该参数会明显降低[43]。本研究中，垂直砂埋处理的藻体Fv/Fm和Y（II）值恢复最快，其次为水平砂埋藻体，网夹栽培藻体Fv/Fm和Y（II）值恢复最初水平的时间比砂埋的藻体长，因为垂直砂埋更接近藻体自然生长的状态，在同一时间点其光合速率越快，藻体光合产物合成越多，藻体能量供给充足，促进藻体生长，而水平砂埋和网夹栽培限制了藻体光照和营养盐的吸收，无附着基质的海葡萄在充气水体中不断翻滚、漂浮，影响藻体叶绿素的合成，其感应重力方向不断变化，体内生长素分配不连续，进而抑制蕨藻的生长，与以往的研究[41,44]相一致。

3.4 不同附着基质对长茎葡萄蕨藻营养积累影响

不同的附着和栽培基质会导致植物体的营养成分发生改变[45-46]。本实验中，水平和垂直沙埋组的可溶性糖含量分别下降 34.24%和33.93%，这与Long 等[45]报道的砂砾底质使长茎葡萄蕨藻可溶性糖含量下降37.96%的结果相似；同时，本研究中垂直砂埋组藻体蛋白质含量明显高于其余组，这可能是因为砂砾基质有助于植物蛋白质合成[47]，对于火山地貌的硇洲岛海域，其砂砾成分中的泥碳与珍珠岩混合基质也会使植物体蛋白含量上升[48]，且垂直沙埋更符合藻体生长特性。

可见，通过调节附着基质组分，可选择性地促进长茎葡萄蕨藻营养物质的积累，为长茎葡萄蕨藻功能性食品开发提供参考。