超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中番茄红素和品质特性的影响

张丽芬，张盼盼，潘润森，陈复生，刘东红，赖少娟

(1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450052；2.河南省南街村(集团)有限公司，河南 漯河 462600；3.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院/智能食品加工技术与装备国家地方联合工程实验室/浙江省农产品加工技术研究重点实验室/浙江省健康食品制造与品质控制国际合作基地，浙江 杭州 310058)

樱桃番茄(LycopersiconesculentumMill.)营养丰富，可作为蔬菜、水果鲜食，亦可加工成果脯、果酒等食品。樱桃番茄中富含的番茄红素是强有效的抗氧化物质，具有淬灭活性氧、消除体内自由基、减缓动脉粥样硬化、预防多种癌症和保护心血管等多种生理功能，其清除单线态氧的能力是β-胡萝卜素的2倍以上，是维生素E的100倍[1]。樱桃番茄皮薄汁多，运输过程中极易发生机械损伤、失水萎蔫，继而出现霉变腐烂，造成大量损耗。

目前，樱桃番茄采后贮藏保鲜方法主要有冷藏、气调、热处理、超声波和化学保鲜剂处理等[2]。研究表明，通过冷藏、气调和浸渍等保鲜方法均能降低果实呼吸强度，延缓各营养成分的变化，从而保持果实较好的营养品质[2-4]；但是，不适宜的冷藏温度易引起果实冷害[3]，气调保鲜投资大，成本较高，且热处理易造成果蔬的热伤害和风味改变。

超声波(ultrasound，U)作为一种非热物理加工技术，近年来在食品行业发展迅速。超声空化效应产生的瞬时高温高压能够有效杀死果实表面的微生物，维持果蔬营养品质。研究发现，番茄果实经超声处理后，风味、营养品质、番茄红素含量和抗氧化能力均得到提高[5-6]。超声波与其他保鲜技术联合使用可起到更佳保鲜效果。浸渍保鲜技术在维持果蔬品质特性方面同样具有独特优势，常用的浸渍液主要有盐酸、水杨酸以及钙溶液等，其中钙在调节果蔬采后生理功能过程中起着关键作用。研究表明，钙浸渍能够维持果实颜色的稳定，延缓果实成熟，并抑制病原菌生长，维持较高的果实品质[7-9]。钙浸渍成本低、操作简易，既能维持果实更好的营养品质，满足人们的消费需求，又能提高果实中钙含量，满足人们的健康需求。超声波协同钙浸渍技术对樱桃番茄中番茄红素影响方面的研究鲜见报道，因此，探索樱桃番茄的超声协同钙浸渍保鲜方法具有现实意义。

本研究拟以樱桃番茄为原料，研究超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中理化品质和番茄红素的影响，希望通过对番茄红素结构特性的分析，揭示超声协同钙浸渍提高樱桃番茄品质的机理。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

樱桃番茄(圣女1416)，采摘于河南省安阳市种植园。

食品级乳酸钙(纯度≥98%)，购自洛阳昊华化学试剂有限公司；番茄红素标品、氘代氯仿(色谱纯)，购自上海麦克林生化科技有限公司；甲酸、乙醇和乙腈(色谱纯)，购自美国CBS公司。

1.2 仪器与设备

SBL-10DT型恒温超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；GL-10000C型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；Waters 1525型HPLC色谱仪，美国Waters 公司；Bruker AVANCE III HD 400型超导核磁共振波谱仪，德国Bruker公司；CR-410型色差计，日本柯尼卡美能达有限公司；TA-XT2i型物性分析仪，英国Stable Micro Systems公司。

1.3 实验方法

1.3.1樱桃番茄预处理

樱桃番茄采摘后即刻送往实验室，挑选大小均匀、无病害的果实分组进行实验，每组样品个数为350个。实验共分为4组：对照组(CK，未进行任何处理)；超声组(U，15 ℃、20 W/L超声处理15 min)；钙浸渍组(Ca，15 ℃、用质量分数为2%的乳酸钙浸渍处理15 min)；超声协同钙浸渍组(U+Ca，15 ℃、2%乳酸钙浸渍，同时20 W/L超声处理15 min)。处理后的样品装入带孔PVC保鲜盒，4 ℃贮藏。每次随机取出20个样品进行测定。

1.3.2樱桃番茄硬度的测定

采用物性分析仪测定番茄硬度，探头直径为35 mm，预压速度3.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s，压后上行速度1.0 mm/s，触发力10 g，下压距离为3 mm，每组样品测试20个樱桃番茄。

1.3.3樱桃番茄色泽的测定

采用色差计测定番茄色泽，在果实上随机选取3个不同的点进行测量，记录L*、a*和b*的值，每组测定20个果实，结果用褐变指数(browning index，BI)表示[10]。

1.3.4樱桃番茄失重率和腐烂率的测定

失重率和腐烂率测定时各处理组均分为3个平行组，30颗果实为一组，共360颗果实。失重率参考Zhang等的方法测定[11]，用电子天平称量贮藏前(m0)和贮藏后(m1)每组果实质量，计算方法如式(1)。

腐烂率采用统计法[12]计算。腐烂级别：0级，无腐烂；1级，腐烂面积小于整个果实的10%；2级，腐烂面积占整个果实面积的10%～30%；3级，腐烂面积占果实面积的30%～50%。计算方法如式(2)。

(1)

(2)

式(1)中：m0为果实贮藏前质量，g；m1为果实贮藏后质量。g。

1.3.5樱桃番茄可滴定酸和维生素C的测定

可滴定酸(TA)含量采用氢氧化钠滴定法测定[13]。称取混合均匀的果肉10.0 g，研磨并转移至50 mL容量瓶中，定容、摇匀，静置30 min后真空抽滤。取滤液20 mL，用NaOH标准溶液滴定。计算方法如式(3)。

(3)

式(3)中：V：样品提取液总体积，mL；Vs：滴定时所取滤液体积，mL；c：NaOH滴定液浓度，mol/L；V1：滴定滤液消耗的NaOH体积，mL；V0：滴定蒸馏水消耗的NaOH体积，mL；m：样品质量，g；f：折算系数，g/mmol。

维生素C含量参考Spinola等[14]方法测定。称取10.0 g果肉，加入少量质量分数为2%的盐酸溶液，冰浴下研磨成浆，转入25 mL容量瓶中，定容、摇匀，提取10 min后过滤。分别取0.5 mL 10 g/L KI溶液，2.0 mL 5 g/L淀粉溶液，5.0 mL提取液和2.5 mL蒸馏水于三角瓶中，用KIO3溶液滴定，至微蓝色不褪为终点。记录所用KIO3溶液体积，重复3次。用5.0 mL 2%盐酸溶液做空白。维生素C含量以100 g样品(鲜重)中含有的抗坏血酸的质量表示，即mg/100 g。计算方法如式(4)。

(4)

式(4)中：V1为样品滴定消耗的KIO3溶液的体积，mL；V0为空白滴定消耗的KIO3溶液的体积，mL；0.088为1 mL 1 mmol/L KIO3溶液相当的抗坏血酸的质量，mg；Vs为滴定时所取样品的体积，mL；V为样品提取液总体积，mL；m为样品质量，g。

1.3.6樱桃番茄钙含量的测定

钙含量采用原子吸收分光光度法检测[15]。称取20～25 g果肉于培养皿中，在105 ℃烘箱中烘至恒重，研磨，称取干物质0.50 g左右，加混合酸[m(硝酸)∶m(高氯酸)=4∶1]消化液20 mL。在调温电炉上加热消解至透明或略带黄色，并蒸发至冒浓白烟，冷却至室温，用20 g/L氧化镧溶液转移至25 mL容量瓶中，定容至刻度。计算方法如式(5)。

(5)

式(5)中：w(Ca)为试样中钙质量分数，mg/100g；ρ(Ca)为测定用试样液中钙质量浓度，μg/mL；ρ0为试剂空白液中元素质量浓度，μg/mL；V为试样定容体积，mL；f为稀释倍数；m为试样质量，g。

1.3.7番茄红素的提取

番茄红素含量参考Fish等[16]的方法测定。称取2.0 g匀浆的番茄果肉置于用铝箔包装的锥形瓶中，加入25 mL含0.125 g二丁基羟基甲苯(BHT)的丙酮溶液，25 mL、95%的乙醇溶液，50 mL正己烷，避光振荡1 h后，加入3 mL预冷的去离子水，继续振荡5 min。室温下静置5 min，分层后，取上清液干燥备用。

1.3.8番茄红素的HPLC分析

标准曲线绘制：将番茄红素标准样品配制成10、20、40、60、80、100 μg/mL的梯度标准工作液，过0.22 μm滤膜。按色谱条件测定，以峰面积为横坐标，以标准溶液质量浓度为纵坐标绘制标准曲线。

色谱条件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，柱温40 ℃，进样量20 μL，流速1 mL/min；流动相A为乙腈，流动相B为乙醇；检测波长450 nm和475 nm；等度洗脱，流动相A和B的体积比为3∶2。

取1 mg冻干的番茄红素样品，溶于1 mL流动相中，样品过0.22 μm滤膜。测定条件同标准样品。

1.3.9番茄红素的核磁共振分析

取适量番茄红素样品用2 mL CDCl3溶解，避光搅拌均匀后离心(10 000 r/min，5 min，4 ℃)，重复2次，收集离心管中红色疏水液体，过0.22 μm滤膜后立即进行核磁共振(NMR)分析[17]。

1.4 数据处理

实验数据用Excel 2010，SPSS 20和GraphPad Prism 5软件进行处理，结果表示为平均值±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中理化品质的影响

超声协同钙浸渍对贮藏期间樱桃番茄理化品质的影响情况见图1。由图1(a)可知，贮藏过程中，果实硬度呈现逐渐降低趋势，且U+Ca组樱桃番茄的硬度显著高于CK组。贮藏第30天，U+Ca组樱桃番茄的硬度(7.89 N)显著高于CK(6.45 N)、U(6.83 N)和Ca组(7.48 N)。结果表明，超声协同钙浸渍技术能够有效抑制贮藏期间果实硬度下降。超声作用使得更多的Ca2+浸入到樱桃番茄果肉组织中，Ca2+与细胞壁中的果胶发生交联形成果胶酸钙，强化了果实细胞壁结构[18]。图1(b)结果显示：U+Ca组褐变指数(BI)显著低于CK和U组(25 d除外)，且在贮藏后期各处理组果实BI趋于稳定。超声协同钙浸渍处理能够有效抑制果实颜色变化，维持果实贮藏期间色泽稳定。

不同大写字母表示同一处理组在不同贮藏时间存在显著差异(P<0.05)；不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理组之间存在显著差异(P<0.05)。

由图1(c)可见，樱桃番茄贮藏期间失重率呈现上升趋势，U+Ca组失重率显著低于CK组。研究表明，Ca2+有助于维持细胞壁与细胞膜的完整性，同时钙的浸入减小细胞间隙，增加水分迁移阻力，从而减缓水分损失[19]。由图1(d)可见，樱桃番茄从贮藏第10天开始腐烂，并在第30天腐烂率超过50%。从贮藏第15天开始，U+Ca组樱桃番茄的腐烂率显著低于CK、U和Ca组，主要由于超声空化作用可杀灭果实表面的微生物，且乳酸钙具有抑制病菌等微生物活性的作用[20-21]。

由图1(e)可知，樱桃番茄的可滴定酸(TA)在贮藏期间呈现先增加后降低的趋势。储藏前期(0～10 d)，果实应对环境变化进行无氧呼吸产生乳酸导致可滴定酸含量增加；中后期(15～30 d)，果实内有机酸作为呼吸底物被消耗，可滴定酸含量降低；贮藏末期(30 d)，U+Ca组樱桃番茄TA含量(4.64%)显著高于CK 和U组(3.94%和4.05%)。超声协同钙浸渍处理有效延缓了贮藏过程中TA含量的下降。对樱桃番茄贮藏过程中维生素C[图1(f)]含量的研究结果显示：贮藏第30天，U+Ca组樱桃番茄维生素C质量分数(2.85 mg/100g)显著高于CK组(2.32 mg/100g)；与新鲜果实(CK0，4.24 mg/100g)相比，U+Ca组和CK组樱桃番茄的维生素C保存率分别为67.21%和54.72%。

2.2 超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中钙含量的影响

超声协同钙浸渍技术对樱桃番茄贮藏过程中钙含量的影响，实验结果如图2。贮藏第0天，U+Ca组樱桃番茄果实中钙质量分数(184.36 mg/100g)显著高于Ca、U和CK组(176.25、155.32 mg/100g和156.96 mg/100g)，超声处理可以显著促进钙向果实内部的渗透。贮藏期间，各处理组果实钙含量变化不显著，但U+Ca和Ca组果实钙含量显著高于U和CK组，并对应于较高的果实硬度[图1(a)]。在超声作用下，更多的钙离子渗透到果实组织，与果胶链中半乳糖醛酸上的羧基结合形成网络结构，增加果胶稳定性，维持和提高细胞壁的完整性和机械性能，进而抑制硬度的下降[22]。超声协同钙浸渍可以降低樱桃番茄贮藏过程中细胞壁分解程度，较好保持细胞膜完整性，维持果实硬度。

不同大写字母表示同一处理组在不同贮藏时间存在显著差异(P<0.05)；不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理组之间存在显著差异(P<0.05)。

2.3 超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中番茄红素含量的影响

超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中番茄红素含量的影响，实验结果如图3。由图3可知，各处理组果实番茄红素和全反式番茄红素含量在贮藏第15天时均达到最大值。贮藏第0～5天，番茄红素作为一种抗氧化剂，抵御果肉组织因冷藏产生的氧化应激，从而其含量下降；贮藏第10～15天，番茄红素合成速率大于消耗速率，积累至最高水平；贮藏后期(15～30 d)，番茄红素合成酶活性降低，组织内呼吸产生的活性氧不断积累，使得番茄红素不断被消耗，导致其含量降低[23]。贮藏第20天起，CK 和U 组番茄红素质量分数(0.87、1.40 mg/100g)显著高于U+Ca和Ca组(0.76、0.67 mg/100g)。这可能是由于超声协同钙处理降低了与番茄红素正相关的酶活性。全反式番茄红素含量变化趋势与总番茄红素一致[图3(b)]。超声协同钙浸渍处理对贮藏期间全反式番茄红素含量无显著影响。

不同大写字母表示同一处理组在不同贮藏时间存在显著差异(P<0.05)；不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理组之间存在显著差异(P<0.05)。

2.4 超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中番茄红素结构特性的影响

樱桃番茄贮藏前后番茄红素1H NMR分析结果如图4。由图4(a)可知，番茄红素标准品的碳碳双键H原子化学位移主要在5.9～6.7，1.61～1.97，2.11和5.11处，分别是—CH3、—CH2和—CH的吸收峰[24-27]。H-8(5)与H-18(5)、H-10(9)与H-19(9)、H-12(13)与H-20(13)分别是5-顺式番茄红素、9-顺式番茄红素和13-顺式番茄红素特征化学键对应的H原子，可用于鉴别相对应的番茄红素存在情况[25,28]。图5为全反式番茄红素、5-顺式番茄红素和9-顺式番茄红素的结构示意图。由图4(c)至图4(f)可知，贮藏末期(第30天)，各处理组樱桃番茄中，番茄红素在化学位移为3.81和4.15处均出现较高的峰，3.81处是—OCH3的吸收峰，4.15处是—OH的吸收峰[24]。CK和U组[图4(c)和图4(d)]中无H-18、H-18(5)和H-10(9)的吸收峰。结果表明，贮藏末期(第30天)樱桃番茄果实中的番茄红素可能被氧化，产生新的氧化产物。贮藏第30天，U+Ca和Ca组存在H-18、H-18(5)和H-10(9)的吸收峰[图4(e)和图4(f)]，这可能与果实中保留较多的维生素C有关，维生素C清除部分游离羟自由基OH·，从而减轻番茄红素氧化程度。

图4 樱桃番茄贮藏前后番茄红素1H NMR谱

图5 番茄红素结构示意图[25，27]

樱桃番茄的番茄红素1H NMR位移分析结果如表1。氢位移分析结果表明，番茄红素标准品中含有全反式番茄红素、5-顺式番茄红素和9-顺式番茄红素。樱桃番茄新鲜样品及贮藏第30天CK、U、Ca和U+Ca组番茄均含有全反式番茄红素、5-顺式番茄红素和9-顺式番茄红素。贮藏第30天，CK和U组无H-18、H-18(5)和H-10(9)的化学位移，Ca和U+Ca组的化学位移完整，表明CK和U组中部分全反式番茄红素、5-顺式番茄红素和9-顺式番茄红素被氧化，而U+Ca和Ca组中全反式番茄红素、5-顺式番茄红素和9-顺式番茄红素的氧化程度较轻。研究结果表明，超声波协同钙浸渍技术能够有效抑制番茄红素及其异构体的氧化程度，维持其结构完整性。

表1 樱桃番茄中番茄红素1H NMR位移

樱桃番茄番茄红素13C NMR分析结果如图6。番茄红素的共轭双键C原子化学位移在123.93～139.53，12.80～25.72处的吸收峰来自—CH3，26.67和40.23处的吸收峰来自番茄红素中两种不同环境的—CH2[24-27,29]。图6(c)中，67.13处的峰对应的是—OCH2的吸收峰，图6(d)、(e)、(f)中具有同样的吸收峰，且无C-8、C-18和C-20吸收峰。结合1H NMR谱图[图4(c)至图4(f)]，推测番茄红素中C-8、C-18和C-20被氧化。本研究结果显示，贮藏末期(第30天)樱桃番茄果实中的番茄红素部分被氧化，结构发生变化。

图6 樱桃番茄贮藏前后番茄红素13C NMR谱

樱桃番茄番茄红素13C NMR位移分析结果如表2。C-8(5)与C-18(5)、C-10(9)与C-19(9)、C-12(13)与C-20(13)分别是5-顺式番茄红素、9-顺式番茄红素、13-顺式番茄红素的特征化学键对应的C原子[25,27]。不同于全反式番茄红素，5-顺式番茄红素的C-8的位移向高场移动，C-18的位移向低场移动；9-顺式番茄红素的C-10的位移向高场移动，C-19的位移向低场移动。贮藏第30天，各处理组全反式番茄红素C原子化学位移对应不完整，且13C NMR谱图中出现含氧基团吸收峰[图6(c)至图6(f)]，但U+Ca和Ca组全反式番茄红素H原子化学位移对应完整(表1)，且C-8和C-18、C-10和C-19符合移动规律。本研究表明，CK和U组中部分全反式番茄红素、5-顺式番茄红素和9-顺式番茄红素受到氧化，而U+Ca和Ca组中全反式番茄红素、5-顺式番茄红素和9-顺式番茄红素的氧化程度较轻，结构保留较完整。

表2 樱桃番茄中番茄红素13C NMR位移

贮藏初期，新鲜樱桃番茄和各处理组樱桃番茄中均含有全反式番茄红素、5-顺式番茄红素和9-顺式番茄红素。贮藏过程中，樱桃番茄发生一系列生理生化反应，番茄红素的含量与结构也随之变化。贮藏末期，CK和U组中番茄红素被氧化，导致果实失去鲜艳色泽，褐变程度加深(图1)。Ca和U+Ca组中番茄红素氧化程度较低，U+Ca组保留了较多的维生素C(图1)，有助于保护番茄红素不被氧化；因此，U+Ca组番茄红素氧化程度较低，结构保存较完整。本研究表明，超声协同钙浸渍能够较好地保留樱桃番茄全反式番茄红素及其顺式异构体的完整结构，抑制番茄红素的氧化，从而维持樱桃番茄品质。

3 结 论

超声协同钙浸渍处理可有效延缓樱桃番茄贮藏期间硬度的下降，促进钙离子向果实内部的渗透；同时可维持果实较高的可滴定酸和维生素C含量，并可抑制果实褐变指数、失重率和腐烂率的上升。与对照组相比，超声协同钙浸渍处理对樱桃番茄全反式番茄红素含量无显著性影响。超声协同钙浸渍有效抑制了樱桃番茄贮藏期间番茄红素的氧化，可较好地维持全反式番茄红素、5-顺式番茄红素和9-顺式番茄红素的结构完整性。超声协同钙浸渍技术可有效维持樱桃番茄贮藏期间良好的品质特性。超声协同钙浸渍技术作为一种非热果蔬保鲜技术，既具备安全、高效和节能等优点，又对人体营养健康有增益作用。该技术是否适合除樱桃番茄以外的水果，并大规模应用于实际的果蔬产业中有待进一步研究。