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高尿酸血症与动脉粥样硬化的相关性及其诱发机制研究

2021-01-29刁力李波

国际医药卫生导报 2021年1期
关键词:偶联高尿酸尿酸

刁力 李波

海阳市人民医院 265100

高尿酸血症是体内嘌呤代谢紊乱和尿酸排泄异常所致的血尿酸水平升高,已经成为一种常见病,不仅可以导致痛风、痛风性关节炎及痛风性肾病,其对心血管系统也有损伤作用,是心血管疾病的独立危险因素[1]。近年来一些研究显示高尿酸可刺激内皮细胞发生功能异常[2-4],但具体机制尚不清楚。内皮细胞功能紊乱是动脉粥样硬化发生的病理基础,在动脉粥样硬化的发病过程中扮演着重要作用[5],对内皮细胞功能受损机制的研究已成为动脉粥样硬化性疾病的研究热点。本研究体外培养HUVEC,观察不同浓度的尿酸对HUVEC的ROS水平、NO含量及eNOS mRNA表达的影响,了解尿酸对内皮损伤的作用途径,以探讨高尿酸血症在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用及其机制,对动脉粥样硬化的防治有应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞(中心实验室友情提供);DMEM、0.25%胰酶/0.02%EDTA、胎牛血清(Hyclone 公司);尿酸(Sigma 公司);青霉素-链霉素双抗(Solarbio 公司);磷酸盐缓冲液(Solarbio 公司);eNOS 抑制剂L-NAME(Selleckchem 公司);无水乙醇、异丙醇(国药集团化学试剂有限公司);PCR 引物(生工生物工程上海股份有限公司);ROS 荧光探针-DHE(威格拉斯生物技术有限公司);NO 试剂盒(南京建成生物工程研究所);总RNA 试剂盒(美国Omega 公司);逆转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒(天根生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 尿酸溶液的配置 1 ml NaOH 液体(1 mmol/L)中加入13.45 mg尿酸粉末,溶解后加至49 ml DMEM 完全培养基中,混匀过滤除菌至50 ml无菌离心管中,吸取300 μl测定其尿酸浓度,由所测结果调整至目标浓度1 600 μmol/L。以DMEM完全培养基稀释尿酸原液至200、400、600、800 μmol/L。

1.2.2 HUVEC 的培养及试验分组 (1)将冻存的HUVEC复苏、培养,调整细胞计数为10×104于12孔板中,设置为5组:对照组(单纯培养基组)、试验组4组(分别为200、400、600、800 μmol/L 尿酸刺激组),各组分别培养24 h、48 h和72 h,观察尿酸对内皮细胞氧化应激的影响。(2)选择结果较稳定的600 μmol/L尿酸刺激组,设置为3组:对照组(单纯培养基组)、试验组(600 μmol/L 尿酸刺激组)、L-NAME干预组(100 μmol/L L-NAME预处理15 min,再与600 μmol/L尿酸溶液共同孵育48 h),观察高尿酸对eNOS 脱偶联的影响。以上每次实验重复3板。

1.2.3 DHE 荧光染色法测定 ROS 水平 5 mmol/L 的DHE溶液加入12孔板中,荧光探针终浓度为5 μmol/L,恒温培养箱避光孵育30 min,PBS清洗。荧光显微镜下观察到有HUVEC 细胞的视野,以绿光激发,阴性对照孔下调整背景荧光强度,观测并记录不同浓度尿酸刺激后HUVEC 内的荧光强度。

1.2.4 上清液NO含量检测 根据NO试剂盒说明书操作,测定细胞上清液NO 含量。每组3复孔。

1.2.5 荧光定量PCR 检测eNOSmRNA 的表达 提取细胞总RNA,测其纯度与浓度。按天根公司KR106 FastQuant RT Ki 试剂盒说明书逆转录合成cDNA。以eNOS为引物、β-action 为内参,按天根公司 FP205 SYBR Green 试剂盒说明书,Bio-Rad 仪进行荧光定量PCR 检测eNOSmRNA 的表达。反应条件:95oC、15 min,95oC、10 sec,60oC、32 sec,循环40 次。△△Ct=(目的基因Ct 值-内参 Ct值)试验组-(目的基因Ct值-内参Ct值)对照组。试验组目的基因对于对照组目的基因的表达量即为2-△△Ct。

1.3 统计学分析 统计学处理采用SPSS19.0软件,数值以(±s)表示。多组间两两比较符合正态分布的采用单因素方差分析(one-way ANOVA)Tukey 法,不符合正态分布的采用Dunnett法,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 尿酸对HUVEC ROS 表达的影响 随着尿酸浓度升高及作用时间延长,600、800 μmol/L 浓度组 ROS 表达显著增强(见图1、表1)。

2.2 尿酸对HUVEC NO 含量的影响 随着尿酸浓度升高及作用时间延长,600、800 μmol/L 浓度组 NO 含量显著下降,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。

2.3 尿酸对eNOS 脱偶联的影响 选择前述试验结果较为稳定的 600 μmol/L 尿酸浓度组,作用 HUVEC 48 h,高浓度的尿酸可以增加细胞内ROS 水平,降低NO 含量及eNOSmRNA 表达;加入 eNOS 抑制剂 L-NAME 之后,显著降低由高尿酸所引起的细胞内ROS 水平并增加NO 含量及eNOSmRNA表达;差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。

3 讨 论

血管内皮细胞通常是指覆盖于血管内膜表面的单层扁平上皮细胞,它形成血管的内壁,是血管壁与血液之间的分界细胞,是血管腔内血液与其他血管壁(如单层鳞状上皮)的接口。它不但具有吞噬功能,是血管的保护膜,而且还是机体重要的内分泌及旁分泌器官,参与免疫活动,包括调节血管舒张与收缩,调节凝血功能,防止血管通透性增加,缓解血管炎症反应等,维持着心血管系统的正常功能。内皮细胞功能紊乱是动脉粥样硬化的始动因素,是造成动脉粥样硬化性疾病高发生率和病死率的重要原因之一,其中的一个主要表现为内皮舒张因子NO的生物利用度下降[6]。

NO 是内皮细胞重要的调节因子之一,主要由一氧化氮合酶(NOS)催化产生。NOS 是一种同工酶,有3 种不同亚型:神经型(nNOS)、诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS),与心血管系统疾病密切相关的是eNOS 和iNOS。eNOS 是调节NO 产生的主要限速酶,于1991 年由Forstermann 和Pollock在内皮细胞中首次发现。eNOS 源性的NO 发挥着调节内皮功能、维持血管平衡,预防动脉粥样硬化的作用。但是某些病理情况下,激活的eNOS 不再产生NO,而是形成超氧阴离子(),即 eNOS 出现脱偶联状态,导致 NO 水平下降和水平升高。研究发现,eNOS 脱偶联可加重内皮损伤,促进动脉粥样硬化等疾病的发生与发展[7]。

图1 尿酸刺激HUVEC内ROS表达(20×镜下观察,曝光时间2 s)

表1 尿酸刺激HUVEC内ROS表达(±s)

表1 尿酸刺激HUVEC内ROS表达(±s)

时间24 h 48 h 72 h t值P值浓度200 μmol/L 1.82±1.35 1.99±1.62 2.37±1.88 3.624<0.05 400 μmol/L 2.19±1.27 2.22±1.34 2.63±1.51 4.008<0.05 600 μmol/L 2.45±1.49 2.95±1.38 3.41±1.08 4.649<0.05 800 μmol/L 3.94±1.05 4.41±1.38 5.04±1.64 4.811<0.05

高尿酸血症与动脉粥样硬化的发展和内皮功能受损密不可分。目前,国内外有关尿酸对血管内皮细胞功能影响的研究不是很多,并且观点存在较大差异。Papezikova I等[8]将尿酸与牛主动脉内皮细胞作用24 h 后发现尿酸呈剂量依赖性降低了NO 的浓度,同时增加了ROS 的产生,损伤了血管内皮细胞;Mishima M 等[9]通过激活人脐静脉内皮细胞中的尿酸转运体,证明尿酸可以减少NO 的产生,引起炎性反应及氧化应激,损伤血管内皮细胞。这些均提示高尿酸血症对心血管疾病有损害作用,但也有人提出相反意见。因此,为了解高尿酸血症对内皮细胞功能的影响及其机制,本实验在HUVEC 与不同浓度尿酸作用不同时间后,采用DHE荧光染色法检测细胞内ROS表达,NO试剂盒检测上清液中NO含量。结果显示,随着尿酸浓度的增加及作用时间的延长,尤其是600 μmol/L 以上尿酸浓度组,作用48 h 以上,HUVEC 上清液NO 含量显著降低,ROS 表达强度显著增加,表明高尿酸可以减少NO生成,激活氧化应激反应,造成内皮细胞损伤,这与前面提到的试验结果一致。

为了研究尿酸对eNOS脱偶联的影响,笔者在分析比较了前述试验结果后,选择结果较为稳定的600 μmol/L 尿酸浓度组,加入eNOS 抑制剂L-NAME,作用48 h,结果发现L-NAME 可以降低由高尿酸所引起的细胞内ROS水平并增加 NO 的含量及 eNOSmRNA 的表达。 L-NAME 是 eNOS 抑制剂,能够阻止电子向L-Arg 或者是分子氧的传递,在正常内皮细胞上,应用L-NAME 抑制eNOS 电子向L-Arg 的传递,导致NO产生减少,而ROS水平反而增高;而当内皮细胞或者组织eNOS 发生脱偶联时,应用L-NAME 后,可抑制电子向分子氧的传递,使得ROS 产生减少。因此采用L-NAME 观察细胞内ROS水平的变化,已成为评定eNOS脱偶联的常用简易方法[10]。

图2 尿酸刺激HUVEC后NO检测

图3 高尿酸引起内皮细胞eNOS脱偶联

因实验时间和器材的限制,本实验只是初步探讨了尿酸对血管内皮细胞氧化应激及eNOS脱偶联的影响,尚未涉及具体的信号通路。但我们的实验表明高尿酸血症可以通过eNOS 脱偶联使内皮细胞发生氧化应激从而导致内皮损伤。因此,逆转由高尿酸引起的eNOS脱偶联具有重要的科学意义,可为高尿酸诱导的动脉粥样硬化性疾病的早期防治提供新的药物作用靶点,为深入研究人高尿酸血症的致病机制及合理的干预措施提供初步证据。

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