高聚合度麦麸阿魏酸糖酯组分对美拉德反应产物抑制作用研究

赵文红，冯丽然，陈 晖，杨国龙

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

谷物中的酚酸可以通过相互结合或协同增效起到抗氧化作用[1]。其中，酚酸与碳水化合物的结合是重要的存在形式[2]，如麸皮中的阿魏酸低聚糖酯(FOs)，它以不同聚合度低聚糖的糖羟基与阿魏酸(FA)羧基酯化的形式存在(图1)。通过酶水解麦麸可以制备FOs。Smith等[3]用Oxyporus纤维素酶水解小麦麸皮细胞壁得到了阿魏酰基阿拉伯木糖。Ralet等[4]用黑曲霉中的阿魏酸酯酶降解麦麸中的阿魏酸低聚糖酯，在其消化液中分离出了阿魏酰基阿拉伯木二糖和木三糖。据报道，FOs的水溶性好，热稳定性高，能促进双歧杆菌的增殖[5]，在自由基清除[6]、油脂抗氧化[7]和蛋白质非酶糖基化[8]等方面表现出很强的抗氧化活性。美国在2010年以麦麸提取物的名义批准将其作为食品添加剂(FDA, GRAS Notice 000343)使用[9]。

(5-O-FA-α-L-Ara)-(1→3)-[O-β-D-Xyl]n图1 阿魏酸糖酯基本结构Fig.1 Basic structure of feruloylated oligosaccharides

α-二羰基化合物是美拉德反应中形成风味化合物的重要中间物质，同时也是反应性极强的糖基化剂[10]，参与美拉德反应AGEs的形成[11]，从而对蛋白质组和基因组造成损伤[12]。其中，GO、MGO和2, 3-BD作为α-二羰基化合物，对人体危害极大[13]，能够引起乳糖不耐症和氧化应激等反应[14]。此外，身体内的AGEs对健康的危害十分广泛，包括引起动脉粥样化、胰岛素抵抗、糖尿病并发症、骨质疏松、衰老等[15]。已有研究表明，FA能够通过清除美拉德反应过程产生的自由基、抑制美拉德产物的形成或者直接与美拉德反应中间产物形成加合物等方式影响美拉德反应[16]。因此，研究抗氧化剂对美拉德反应产物的抑制作用具有现实意义。FOs这种新型的功能性添加剂对美拉德反应产物形成的影响研究鲜见相关报道。

作者采用凝胶层析技术制备得到组分F1，通过模拟美拉德反应体系，研究F1对美拉德反应产物的抑制作用。以期为高活性FOs的筛选与制备提供理论依据，促进FOs在食品特别是高温焙烤食品等方面的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麦麸：郑州金苑面业有限公司；谷朊粉：高要市蜜丹儿商贸有限公司；聚苯乙烯标准品：上海源叶生物科技有限公司；Sephaden LH-20凝胶：索莱宝生物科技有限公司;甘氨酸、乙二醛：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、磷酸氢二钠、柠檬酸：天津市科密欧化学试剂有限公司；2, 3-丁二酮：山东西亚化学股份有限公司；丙醛酮：上海麦克林生化科技有限公司；邻苯二胺：天津市大茂化学试剂有限公司；乙腈和冰乙酸为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-6100S紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；XMTD-8222电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；RE-6000A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂;1260 InfineityⅡ高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；F-7000荧光分光光度计：日本日立高新技术公司；7890气相色谱仪：安捷伦科技有限公司;LGJ-10C冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 F1的制备

F1的制备见文献[17]。收集合并第一个吸收峰对应的洗脱液，浓缩后冷冻干燥即得F1。

1.3.2 F1的紫外光谱分析

采用紫外可见分光光度计在220～400 nm扫描范围内对色谱凝胶柱分离得到的F1和标准FA样品进行紫外全波长扫描，得到图谱,进行组分的定性鉴别。

1.3.3 F1结构组成的分析

将不同分子质量(分别为210、580、850、1 300、1 780 Da)的聚苯乙烯标准品用1.0 mL四氢呋喃溶解后加入25%乙醇溶液配制成2.0 mg/mL的标准溶液。在Sephadex LH-20层析柱中用四氢呋喃与25%乙醇(体积比为1∶ 10)的混合溶液作洗脱液，以0.5 mL/min的流速洗脱，测定每种标准品的保留时间，以保留时间为横坐标，标准品分子质量为纵坐标，作标准曲线，得到聚苯乙烯平均分子质量与保留时间的方程。

将分离得到的F1样品(6 mL)上样于同一个Sephadex LH-20柱中，用25%乙醇溶液以0.5 mL/min的流速洗脱，得到相应的洗脱图谱，读取相应组分的保留时间。按照上述方程计算得到该组分的平均分子质量。并结合F1的GC、HPLC和红外光谱结构表征结果[18]，解析其组成。

1.3.4α-二羰基化合物的HPLC检测

对α-二羰基化合物进行HPLC分析，需要先进行衍生化，生成喹喔啉衍生物[19]。分别配制质量浓度均为2、4、10、20、40、100 μg/mL的GO、MGO和2, 3-BD，分别取2.0 mL上述溶液于试管中，加入2.0 mL邻苯二酚(0.6%)后置于60 ℃水浴锅中反应4 h进行衍生化处理，以生成相应的喹喔啉、2-甲基喹喔啉和2-(2, 3, 4-三羟基丁基)-喹喔啉。反应结束后反应液过0.45 μm有机滤膜，然后进行HPLC检测分析。

HPLC检测条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)；流动相为V(乙腈)∶V(0.1% 醋酸溶液)=0.30∶0.70；流速为1.0 mL/min；检测波长为315 nm；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。之后分别分析3种α-二羰基化合物的质量浓度与对应峰面积的线性关系。

1.3.5 F1对α-二羰基化合物的抑制率的测定

参考姚胜文[20]和黄启瑞[21]的方法及其优化后的条件，经过适当修改，利用葡萄糖和谷朊粉构建美拉德反应体系。以0.1 mol/L柠檬酸溶液和0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液配制pH 8.0的缓冲溶液。准确称取7.0 g葡萄糖于烧杯中，用pH 8.0的磷酸缓冲液溶解后转移至100 mL容量瓶中定容，配制80 mg/mL的葡萄糖溶液。用pH 8.0的磷酸缓冲液配制50 mg/mL的F1溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL F1溶液于比色管中，加入缓冲液使终体积为1.0 mL，分别向比色管中加入10 mL葡萄糖溶液和0.3 g谷朊粉(忽略谷朊粉对反应体系体积的影响)，充分混匀后放入预先已经升温至120 ℃的烘箱中反应60 min，结束后立刻放入冰水浴中终止反应。反应液定容至15 mL转移至离心管中，5 000 r/min离心10 min，取上清液2.0 mL于干净试管中，加入2.0 mL邻苯二酚，60 ℃水浴4 h进行衍生化，反应结束后过0.45 μm有机滤膜进行HPLC检测(检测条件同前)，以FA为对照，每组重复3次。检测结果与GO、MGO和2, 3-BD的出峰时间作对比，积分得到相应峰面积，依据相应的α-二羰基化合物的标准曲线计算得出相应浓度，并按照公式(1)计算F1对α-二羰基化合物的抑制率。

(1)

式中：C0为反应混合物中不含F1时α-二羰基化合物的质量浓度，μg/mL；C1为反应混合物中含有F1时α-二羰基化合物的质量浓度，μg/mL。

1.3.6 F1对AGEs的抑制率的测定

参考康世墨[22]的方法并经过适当修改，利用葡萄糖和甘氨酸构建美拉德反应体系。分别称取4.0 g葡萄糖和3.0 g甘氨酸于烧杯中，用pH 8.0的磷酸缓冲液(0.2 mol/L)溶解后转移至50 mL容量瓶中定容，配制80 mg/mL的葡萄糖溶液和60 mg/mL的甘氨酸溶液。用pH 8.0的磷酸缓冲液配制50 mg/mL的F1溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL F1溶液于比色管中，加入缓冲液使终体积为1.0 mL，分别向比色管中加入2.5 mL葡萄糖溶液和2.5 mL甘氨酸溶液，充分混匀后放入预先已经升温至80 ℃的恒温水浴锅中反应1.5 h，结束后立刻放入冰水浴中终止反应。蒸馏水定容反应液至10 mL，然后用荧光分光光度计检测样液的荧光响应值，以FA为对照，每组重复3次。荧光分析条件为激发波长370 nm，发射波长440 nm。根据不同质量浓度F1反应体系的荧光强度大小，利用公式(2)计算F1对AGEs的抑制率。

(2)

式中：AU0为反应混合物中不含F1时的荧光强度，a.u.；AU1为反应混合物中含有F1时的荧光强度，a.u.。

1.3.7 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析，以x±s表示结果，组间比较采用多因素方差分析，组内比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 F1的结构特征分析

F1和FA经紫外全波长扫描，见图2，结果显示在325 nm左右出现最大吸收峰，并且峰形出现一定红移。Jankovska等[23]的研究表明未水解的酯化阿魏酸紫外吸收光谱会出现一定程度的红移。结果表明F1结构中含有结合型的阿魏酸结构。同时，课题组此前将F1组分碱水解后经HPLC法检测,显示其含有阿魏酸组分；红外光谱分析显示F1组分在1 735 cm-1附近有吸收峰，表明酯键的存在，896 cm-1左右的吸收峰表明β(1-4)吡喃糖苷键的存在；GC法检测F1组分糖体组成为阿拉伯糖和木糖[18]。研究结果表明：F1组分为阿魏酸通过酯键连接在阿拉伯木糖糖体上的糖酯结构。

图2 Sephadex LH-20凝胶柱洗脱组分F1和FA的紫外全波长扫描图谱Fig.2 Ultraviolet full-wavelength spectra of eluted fractions F1 and FA with Sephadex LH-20 gel column

2.2 F1的结构组成分析

不同分子质量聚苯乙烯标准品的Sephadex LH-20凝胶柱洗脱图谱见图3a，在该试验条件下，聚苯乙烯分子质量与保留时间之间的回归方程为y=-712.1ln x+4 484.5，其分子质量与保留时间有良好的相关性，决定系数达到0.989 8。分子质量-保留时间拟合曲线见图3b。F1在此色谱条件下的出峰时间为(52±2) min，根据方程计算可知该样品的平均分子质量为(1 671.17±27.40) Da。据前期研究：GC法检测麦麸F1组分糖体组成中阿拉伯糖和木糖的摩尔比为1∶ 9.46；DNS法测定F1组分的平均聚合度为10.9[17]，推测F1可能的结构组成为FA-ara-(xly)9，即含有9个木糖个数的阿魏酸糖酯。经计算该组分的分子质量为1 675.49 Da，该结果与Sephadex LH-20凝胶色谱柱的平均分子质量检测结果一致。

图3 聚苯乙烯标准品的Sephadex LH-20凝胶柱洗脱图谱及其分子质量-保留时间曲线Fig.3 Gel column elution profile of polystyrene standard and its molecular weight-retention time curve

2.3 F1对模拟体系中间产物α-二羰基化合物生成的影响

2.3.1 3种α-二羰基化合物的HPLC分析与线性分析

美拉德反应产物α-二羰基化合物经邻苯二胺衍生化生成喹喔啉后可利用HPLC法检测。3种α-二羰基化合物的HPLC图谱见图4。由图4可知，GO、MGO和2, 3-BD的出峰时间分别为4.277 min、5.068 min、6.247 min(2.082 min左右的峰为邻苯二酚的特征峰)。

由图4可进一步分析3种α-二羰基化合物的质量浓度与对应峰面积的线性回归关系，结果见表1。在2～100 μg/mL范围内，此线性回归方程的R2均在0.999 9以上，最低检测限为10 ng/mL。结果表明：3种α-二羰基化合物标准曲线的线性关系良好，可进行组分F1对模拟体系中的3种美拉德反应产物α-二羰基化合物的影响研究。

2.3.2 F1对3种α-二羰基化合物生成的影响

以FA为对照，研究F1对美拉德反应中间产物α-二羰基化合物的影响，结果见图5。

图5 F1和FA对α-二羰基化合物的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of F1 and FA on α-dicarbonyl compounds GO, MGO, and 2, 3-BD

从图5的整体走势看，F1和FA对美拉德反应产物GO、MGO和2, 3-BD这3种α-二羰基化合物的生成均具抑制作用，且其抑制率随着质量浓度的增加呈上升趋势。

由图5a可知，当质量浓度为10 mg/mL时，FA促进GO的生成。随着质量浓度的升高，F1和FA对GO的抑制率升高，经过统计学分析发现，F1对GO的抑制率显著优于FA(P<0.05)；当质量浓度为50 mg/mL时，F1和FA对GO的抑制率分别为63.64%和57.18%，其抑制率无显著性差异(P>0.05)。在美拉德反应过程中，糖分子的碳链裂解会形成GO，该过程中会有羰自由基、羟自由基等的生成，而F1具有优良抗氧化能力[24]，因此,能够清除这些自由基从而抑制GO的形成。

由图5b可知，当质量浓度为50 mg/mL时，F1和FA对MGO的抑制率分别为46.65%和33.49%，经SPPS分析，F1质量浓度对抑制MGO的生成具有显著影响(P<0.05)，同时FA对MGO的抑制率显著低于F1(P<0.05)。F1对MGO的抑制效果优于FA。

由图5c可知，随着质量浓度的升高，F1和FA对模拟体系中2, 3-BD的抑制率逐渐升高。当质量浓度为50 mg/mL时，F1和FA对2, 3-BD的抑制率分别为76.74%和64.85%，经过统计学分析发现，F1质量浓度对抑制2, 3-BD的生成具有显著影响(P<0.05)，F1和FA对2, 3-BD的抑制率不存在显著差异(P>0.05)。F1和FA均表现出优异的清除2, 3-BD的能力。

2.4 F1对模拟体系中AGEs生成的影响

以FA为对照，研究F1对美拉德反应AGEs生成的影响，结果见表2。

表2 F1和FA对AGEs生成的影响 Table 2 Effects of F1 and FA on the formation of AGEs

由表2可知，F1和FA对模拟体系中生成的AGEs表现出抑制作用，并且其抑制作用随着质量浓度的升高而增强。当质量浓度为50 mg/mL时，F1和FA对AGEs的抑制率分别为97.50%和94.76%。当质量浓度达到30 mg/mL以上时，FA的质量浓度对抑制AGEs生成没有显著影响(P>0.05)。F1和FA能很好地抑制美拉德反应过程中的α-二羰基化合物，而作为AGEs的反应底物，α-二羰基化合物的减少能有效抑制AGEs的生成，因此,F1和FA均表现出优异的抑制AGEs的能力。

3 结论

本研究采用凝胶层析技术制备得到高聚合度麦麸FOs组分F1，并对其组成特征进行了分析，得到平均分子质量为(1 671.17±27.40)Da，结合聚合度计算可知其分子组成可能为阿魏酰基阿拉伯木九糖。构建食品美拉德模拟体系，研究F1对美拉德反应中间产物及终产物的影响。结果表明：F1和FA均能够很好地抑制GO、MGO和2, 3-BD 3种中间产物的产生，并且其抑制作用呈浓度依赖关系。总体来说，F1和FA对3种主要α-二羰基化合物抑制效果顺序为2, 3-BD>GO>MGO。此外，F1和FA均对终产物AGEs表现出很好的抑制作用，由于F1能有效抑制美拉德反应的中间产物α-二羰基化合物的产生，从而能够抑制AGEs的生成。