免疫分析技术在农药残留分析中的研究进展及在中药中的应用展望

赵志高,骆骄阳，付延伟，徐媛媛,王长健,杨世海，杨美华*

(1.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

随着中药行业逐渐国际化，中药材不仅在中国受到关注，在全世界的地位也不断上升。在中药材使用量及出口量增加的同时，其质量和安全问题也逐渐被重视，其中农药残留是被关注的焦点之一。不同国家和地区的相关组织对农药残留问题高度重视，《中国药典》、《欧洲药典》等对农药残留做出了限量规定[1]。农药残留检测常用的仪器分析技术有气相色谱法[2]、液相色谱法[3]、气相色谱-质谱联用法[4-5]等。仪器分析方法具有定量准确、高分辨的特性，但也存在一定的局限性，比如仪器体积大，检测用时久，费用昂贵，难以满足快速、现场检测的需求。免疫分析技术是基于抗体与抗原或半抗原之间的特异性识别反应而建立的一种生物化学分析法，相比于仪器检测，免疫分析在农药残留检测中的应用更加快捷、经济，可实现农药残留的现场快速检测。目前免疫方法更多地应用于环境和食品检测[6-7]领域，在中药材中的应用有很大的发展空间。本文对免疫分析技术在农药残留分析方面的研究现状进行了概述，对比分析了不同免疫分析技术在农药残留检测中的优缺点，并对免疫分析技术在中药农残检测中的应用前景进行了展望，以期为中药安全用药提供保障。

1 免疫分析技术的发展趋势及特点

免疫分析技术最初主要应用于医学和生物学领域，大多用于肿瘤标记物筛查和激素类物质的检测[8-9]，该技术以抗原抗体的特异性结合为基础，通过对抗原或抗体进行标记达到信号检测的目的。目前，免疫分析技术在多个领域受到重视，如药物分析[10]、外源污染物分析[11]、文物保护[12]等领域。

免疫分析技术作为一种操作简单、快速、灵敏度高且经济的检测技术，近年来在农药残留分析方面的应用飞速发展。免疫分析技术起初只能进行单一组分检测，且多为定性分析，随着新技术和检测仪器的开发和不断优化，多组分高通量检测的免疫分析技术正在不断地被开发应用，可实现半定量或定量分析[13-14]。

2 应用于农药残留的免疫分析技术

表1 免疫分析方法的主要类型及初步归类Table 1 Main types and classification of immunoassay techniques

2.1 放射免疫分析

放射免疫分析(RIA)技术是将放射性同位素与免疫分析方法相结合的检测技术，该技术采用放射性同位素取代分子中的原子，通过检测放射信号进行分析检测，方法灵敏度高，且不易受到干扰，在生物活性物质检测方面应用广泛。Yamamoto等[38]利用放射免疫法分析并确定了海星中的松弛素样促性腺肽为第一个无脊椎动物促性腺激素。Chang等[39]通过放射免疫分析技术研究了芍药中的有效成分芍药总苷抗关节炎的作用机制。RIA的放射性会对环境和人类造成一定的威胁，在农药残留方面的应用存在一定的局限性。随着科技的发展，人们逐渐找到替代放射性元素的标记物，如荧光标记物和酶标记物等。

2.2 酶联免疫分析

酶联免疫分析(ELISA)是经典的免疫分析技术，也是用于农药残留检测的最主要的免疫分析手段之一。ELISA主要在聚苯乙烯微孔板上进行抗原抗体的特异性结合，根据反应原理的不同，又分为直接竞争法和间接竞争法。ELISA在农药残留分析方面应用广泛，对有机磷、有机氯、氨基甲酸酯等农药均可进行检测分析[40]。Okazaki等[41]建立了一种直接竞争ELISA方法，用于蔬菜中百菌清的检测，采用百菌清类似物五氯苯酚的羧基衍生物合成百菌清半抗原，并通过免疫动物获得高灵敏抗体，所建立的方法快速、简单，适用于黄瓜、茄子等蔬菜中百菌清含量的测定。通过结合新型仿生材料技术，ELISA得到进一步发展，Zhang等[6]利用分子印迹聚合物建立了一种基于仿生材料的酶联免疫吸附法(BELISA)用于食品药品中杀虫剂甲萘威的检测，并通过基于抗体的ELISA方法进行验证，结果显示BELISA方法稳定、可靠，成本更低。仿生材料在ELISA检测农药残留中的应用是一个新的突破。

酶放大免疫分析(EMIA)技术是一种均相反应体系的酶联免疫方法。该方法将酶标记于农药上，在同一体系中加入酶标记农药、抗体和待测样品，酶标记农药与待测样品中的农药分子竞争结合抗体，抗体与酶标记农药的结合导致酶的活性中心受到影响，催化活性被抑制，随后即可根据反应后体系中酶的活性变化计算农药含量。该技术在临床血药浓度的检测中是一种很好的方法[42-43]，但在中药材农药残留分析中，由于每一种待测农药都需要进行酶标记，故应用存在一定的局限性。

2.3 荧光免疫分析

荧光免疫分析(FIA)技术是将不同的荧光素作为标记物修饰在抗原、抗体上进行分析检测。主要包括荧光偏振免疫技术(FPIA)、时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)、底物标记荧光免疫技术(SLFIA)和荧光猝灭免疫技术(FQIA)等。

2.3.1 FPIA分析FPIA是一种在均相反应体系进行的免疫方法，该技术将荧光偏振原理与免疫分析结合，根据荧光标记的抗原与抗体结合前后偏振值发生的变化进行农药残留分析[44]。Liu等[45]使用两种不同的荧光剂标记三唑磷半抗原，建立了一种快速均相的三唑磷农药荧光偏振免疫分析方法，该方法的IC50达3.62 mg/L。相比其他非均相免疫分析技术，FPIA反应速度快，但灵敏度较低，仍有很大的发展空间。Wang等[46]将纳米技术与荧光偏振技术结合，利用小分子纳米抗体代替传统抗体对菊酯类杀虫剂进行检测，在FPIA高度依赖分子量的情况下，通过优化，并与常规抗体对比，开发了可以满足FPIA灵敏度要求的小分子纳米抗体，方法更加绿色、经济、简单。

2.3.2 TRFIA分析TRFIA是将荧光寿命较长的稀土离子螯合物作为抗原或抗体的标记物，通过检测时间延迟后的荧光信号而开发的一种免疫分析方法[47]。该方法有效地降低了本底瞬时荧光的干扰，灵敏度和准确性较其他荧光免疫法更高。TRFIA在有机磷和氨基甲酸酯类农药检测中应用较多，Rubio等[19]通过建立的TRFIA同时分析植物中甲萘酚、甲萘威、多菌灵的含量，结果几乎没有假阳性。

2.3.3 SLFIA分析SLFIA属于竞争型免疫分析方法，其原理是对免疫反应中的抗原或抗体进行荧光底物标记，此时的标记物不具有荧光。在进行SLFIA时，向反应体系中加入水解酶，抗体与抗原的结合阻碍了水解酶接近荧光底物，导致荧光底物不会被水解，而未结合抗原或抗体上的底物则会被酶水解，释放荧光，根据荧光信号的强弱可实现待测化合物的检测[48]。目前该方法的应用仍存在一定局限性，在农药残留检测方面少有报道。

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2.3.4 FQIA分析FQIA将荧光猝灭与免疫技术相结合，采用金属离子螯合物标记抗原抗体，基于加入猝灭剂后体系发生能量转移和荧光信号减弱的现象[49]进行检测。由于荧光分子自身存在荧光猝灭效应，导致荧光检测的灵敏度较低[50]，而直接将荧光猝灭获得的能量转化为检测信号，则可大大降低荧光损耗和荧光背景的干扰，提高检测灵敏度。FQIA技术目前多应用于医学和生物学领域，在农药方面也有部分应用，Dahiya等[51]研究了有机磷农药毒死蜱的代谢物在不同溶剂中的荧光猝灭作用，发现农药在人体中可能存在多种形态分布。Sharma等[52]在抑制荧光自猝灭的基础上建立了一种高敏免疫方法用于检测除草剂敌草隆，采用甘油优化荧光标记物的微环境，大大提高了反应的灵敏度和稳定性。此类高灵敏的荧光猝灭法在农药残留等外源污染物分析方面的应用有待进一步研究。

2.4 免疫层析技术

免疫层析(IC)技术是一种将抗原与抗体的特异性与层析技术相结合的检测技术，其原理简图如图1所示。以待测物溶液为流动相，反应后标记物在显色带聚集显色，通过显色情况进行定性定量。标记物的灵敏度对免疫层析技术十分重要[53]。IC具有操作简单、成本低、易携带等特点，是一种有极具优势的快速检测技术[54]。根据使用的标记物不同可将免疫层析技术分为胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、量子点层析技术、荧光微球层析技术、时间分辨荧光免疫层析技术、磁珠免疫层析技术、适配体层析技术，统称为免疫试纸条技术(IST)。

IST作为一种相对新颖且应用广泛的分析技术，近年来的发展十分迅速，起初的IST只能进行定性分析，目前该技术已可进行半定量或定量分析。Hua等[55]采用基于胶体金抗体探针的免疫层析技术对水样中甲基毒死蜱进行定性和半定量分析，甲基毒死蜱在50～12 150 ng/mL质量浓度范围内呈良好线性，所有反应在10 min内即可完成，方法简单快速。IST不仅可用于农药残留检测等痕量分析，也可应用于中药材常量分析，Duan等[56]建立了一种试纸条技术用于雷公藤甲素的含量检测；Zou等[57]尝试将量子点试纸条结合到传感器上检测有机磷类农药毒死蜱，该方法可在15 min内完成检测，快速且定量准确；Wang等[58]将双量子点与高活性纳米材料结合，实现了双纳米材料的信号放大，该方法已应用于3种有机磷农药的检测，是一种高灵敏的可视免疫层析技术。

基于甲基对硫磷和吡虫啉两种农药发光信号出峰时间的差异，Shu等[59]建立了一种时间分辨化学发光免疫层析方法对两者进行同时检测，方法对甲基对硫磷和吡虫啉的线性范围均为0.1～250 ng/mL，检出限均为0.06 ng/mL，线性和灵敏度良好，并成功用于甘草和当归等实际样品的检测。Zhang等[60]将磁性材料和纳米材料结合作为标记物，制备了一种基于磁致荧光猝灭的可视化免疫层析试纸条，并对两种肿瘤标记物进行同时检测，结果证明该方法抗干扰能力强、特异性和灵敏度高。

随着技术的不断发展，目前IST不仅可进行单一农药残留的检测，多组分农残测定的免疫分析技术也不断被报道。Tang等[61]结合时间分辨荧光与试纸条免疫层析技术建立了一种同时检测农药残留和真菌毒素的新方法，并用于谷物中黄曲霉毒素和氨基甲酸酯类农药的检测。Li等[62]将表面增强拉曼散射(SERS)与免疫分析方法相结合，用于两种拟除虫菊酯农药氯氰菊酯和顺式氰戊菊酯的检测，通过抗原和抗体的特异性结合，将已标记金纳米颗粒的抗体固定在免疫试纸条的结合垫上，同时以两种农药抗原在硝酸纤维素膜上包被两条检测线，在层析过程中，供试液中的目标农药与检测线上的抗原竞争结合金纳米颗粒标记的抗体位点，以达到双重检测的目的。该方法对氯氰菊酯和顺式氰戊菊酯的检出限分别为2.3×10-4、2.6×10-5ng/mL，其灵敏度是酶联免疫分析法和荧光免疫分析法的3～4倍。

适配体层析技术采用非抗体物质作为“化学抗体”，如将从体外筛选出的单链寡聚核苷酸序列作为核苷酸适配体，该适配体对靶物质识别性高、亲和力强。以适配体代替抗体与抗原进行特异性结合，省去了抗体制备步骤，且更加经济，同时可以避免一些结构相似化合物存在交叉反应的情况[63]。

2.5 化学发光免疫分析

化学发光免疫分析(CLISA)是将免疫分析的特异性与化学发光的高灵敏性相结合的一项技术。该技术采用发光剂或催化剂等化学发光试剂标记抗原或抗体，在进行免疫分析时，通过测定化学发光强度来进行待测物的定量分析[64]。根据标记对象的不同，CLISA可分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析[65]。CLISA方法特异性强，检测速度相对较快，操作简单，可实现自动化，且费用较低，但需要寻找合适的发光标记物。所用发光剂的种类主要分为鲁米诺类、二氧杂环丁烷类、吖啶酯类和过氧化草酸酯类等。程燕[66]建立了一种化学发光免疫分析方法检测有机磷农药毒死蜱，结果表明CLISA比ELISA具有更高的灵敏度，同时线性范围较宽，适用于农药残留的检测。

化学发光酶免疫分析(CLEIA)是将化学发光与酶联免疫分析法相结合的技术，相比于常规CLISA，该技术可更大程度地提高反应灵敏度。邹茹冰等[7]基于同时识别对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷3种农药的宽谱特异性抗体，建立了一种同时检测这3种农药的化学发光酶免疫分析法，对3种农药的IC50分别为5.43、1.34、1.24 μg/kg，方法线性和灵敏度良好，可用于水果和蔬菜中农药残留的检测。

电化学发光免疫(ECLIA) 是一项基于电化学反应引起化学发光而进行分析检测的新型技术[67]。相对于CLISA，该技术可控性更强，灵敏度更高，更加经济。单云等[68]利用石墨烯标记抗原，在纳米晶膜上建立了一种检测蔬菜中噻虫啉的电化学发光免疫分析方法，抗原与纳米晶膜表面的抗体结合后，具有良好导电性的石墨烯可引起纳米晶膜发光，增强检测信号。该方法对噻虫啉的检测范围为0.1～10 pg/mL，线性良好且检出限远低于欧洲药典的最低限量标准0.05 mg/kg[69]，在中药材检测中的应用前景十分广阔。

2.6 毛细管电泳免疫分析

毛细管电泳免疫分析(CEIA)将毛细管电泳技术与免疫分析技术相结合，具备良好的特异性和分离效率，可进行多组分同时分析[70]。该技术中的免疫反应在毛细管电泳柱前或柱内进行，并通过毛细管电泳将抗原、抗体与抗原抗体复合物进行分离，然后进行定量分析。

CEIA为均相反应体系，省去了繁琐的洗涤和分离步骤，分析速度相对较快。同时，由于毛细管分离不同抗原抗体结合物的迁移时间不同，降低了免疫分析中的假阳性率。张灿等[30]采用毛细管电泳免疫分析法检测了氨基甲酸酯类农药西维因，仪器平衡时间和检测时间共需35 min，相比酶联免疫分析法耗时短，同时需要的抗体相对较少。Zhang等[71]将金属纳米材料作为分析结合物，实现了CEIA信号的放大，提高了方法的分辨率和灵敏度，增强了CEIA在农药残留分析检测中的实用性。

图2 便携式免疫芯片系统[76]Fig.2 Portable immune chip system[76]

2.7 免疫芯片

免疫芯片是将高特异性的免疫反应与电子芯片技术相结合的一种高通量、高特异性的新型生物检测技术[72]，又称抗体芯片[73]。抗体芯片技术主要采用微阵列点样法将抗原抗体固定于玻片、硅胶板或多孔板上，使其高度集成，然后进行免疫反应。该技术对大分子化合物和小分子化合物检测均适用，在农药残留检测中的应用最为广泛[74]。相比于传统免疫分析方法，免疫芯片的主要优势在于多组分同时分析和灵活便携，且样品用量少[75]。Lan等[31]设计了一种免疫芯片用于农药残留的多组分免疫测定，该方法将抗原固定在硝酸纤维素膜上，并通过纳米金进行标记和信号放大以提高灵敏度，对7种农药进行同时分析检测，检出限为0.02～6.45 ng/mL，方法稳定性良好且灵敏度得到很大提高。将免疫芯片进一步优化，可使检测更加方便快捷，Lee等[76]利用表面等离子共振免疫芯片和简单的便携式成像器，对吡虫啉农药进行快速检测，检测器由廉价的发光二极管、窄带滤波器和智能手机组成，原理见图2。当分析物置于芯片表面，光谱图像的最亮点被转移，分析物定性和半定量分析可以通过裸眼或智能手机观察芯片上斑点的移动来进行。该方法同时检测不同浓度的吡虫啉农药的视觉检出限约为1 ng/mL，并可通过智能手机对图像进一步处理，提高检测灵敏度。这种便携式感应平台具有多种优势，如可进行半定量和定性分析，成本较低且可实现现场快速检测等。但作为一项功能强大、灵活、便携的新型产品，其价格仍然昂贵，在实现快速检测方面的实用性有待提高。

2.8 免疫传感器

免疫传感器是将高特异性的免疫分析技术与高灵敏性的传感器技术相结合的一种免疫分析技术。该技术以抗原抗体作为识别系统，传感器作为信号放大系统，提高了免疫分析的灵敏度，实现了免疫分析技术的定量分析和自动化操作，同时免疫分析传感器正不断向着更加快速、简单、方便的方向发展[77]。

Maja等[78]开发了量子点和荧光共振能量相结合的新型纳米免疫传感器，其功能更加卓越，荧光探针亮度更高，检测更加灵敏，多组分检测时不同量子点可从一个光源激发而不产生发射信号重叠，结果更加准确可信。Patta等[79]发明了一种新型免疫传感器用于检测三嗪类农药莠去津，方法将使用静电防氧化锰纳米纤维的电化学检测与免疫传感器结合，进行无标记的莠去津农药残留分析，该方法性能优越、操作简单、灵敏度高，定量限达0.22×10-21g/mL。Du等[37]首次将生物条形码技术结合免疫分析技术用于农药三唑磷的检测，条形码结合微孔板用于信号放大，定量限达1.96×10-2ng/mL。崔雪妍等[80]将生物条形码技术与免疫分析技术结合用于水果中毒死蜱的检测，通过生物条形码及互补DNA修饰的金纳米颗粒偶联抗原，并结合聚合酶链式反应(PCR)构建了新型生物传感器，通过PCR进行信号放大，该方法的灵敏度得到提高，定量限为0.27 ng/mL。虽然生物条形码技术结合免疫分析的方法更加灵敏、快速，但材料制备过程复杂以及特殊耗材昂贵等因素一定程度上阻碍了该方法的普及应用。对比发现，目前部分免疫分析方法的灵敏度和稳定性可媲美仪器分析技术，同时检测相对快速、便捷，有着良好的发展前景[81]。

在免疫分析原理的基础上，研究者进行了拓展延伸，Tang等[82]提出了一种新型的检测策略，将量子点与经过氨基修饰的核苷酸偶联，并使偶联物与有机磷农药的DNA适配体特异性结合，随后利用激光诱导的毛细管电泳进行分析检测。目前已成功用于氧化乐果、甲拌磷、丙溴磷和水胺硫磷的测定。该方法通过改变DNA适配体序列的类型即可实现其与不同农药的特异性结合，有望成为农药残留快速检测的常用方法。

3 免疫方法在中药材农药残留检测中的应用

不同的免疫方法在应用领域和操作特点上优势互补，相辅相成，可以更好地发挥免疫分析方法在农药残留检测中的优势。本文对近年来报道的一些免疫技术的特性及应用进行归纳总结，结果见表2。通过对分析的样品的种类进行对比发现，在环境和食品样本中免疫分析技术有着更广泛的应用，如谷物、蔬菜和饮用水等。而在基质较为复杂的中药材中的应用较少，但对于“药食同源”的枸杞、人参和甘草等的研究仍有相关报道。通过对检出限的对比分析发现，ELISA、IST、CLEIA和FQIA等方法的检出限相对较高，而免疫芯片和免疫传感器方法的检出限低，甚至达到皮克级以下，有着更高的灵敏度。对比分析方法的使用特点，发现不同分析方法在定性和定量分析中各有优势，如常用的经典定量分析方法主要包括ELISA、CLEIA和FPIA等，定性研究则常采用IST技术。随着检测仪器配套使用的逐步推广，一些定性研究方法如IST技术在定量检测中逐渐大放异彩。从农药检测品种来看，针对单一品种而开发的免疫分析技术逐渐被多农药同时检测技术所替代，免疫芯片和生物传感器技术成为近年来研究的热点。

表2 免疫分析技术在农药残留检测方面的应用Table 2 Application of immunoassay in pesticide detection

(续表2)

4 总结与展望

4.1 免疫分析技术检测农药残留的优势与主要瓶颈

免疫分析技术的优势主要体现为灵敏度高、检测速度快、操作简单，在农药残留检测方面同样如此。常用的免疫分析方法，如酶联免疫法准确度高、重复性好，免疫层析试纸条技术则操作简单快速，两者均便于推广和普及，同时也是目前免疫分析技术中应用最广、最贴近人们生活的免疫分析技术。另外，免疫分析新技术的开发或经典免疫分析技术与新技术的结合，如免疫技术与电化学、光学、物理学等其他领域的结合应用等，不仅大幅提高了检测效率，还实现了高通量和超敏检测。新型的标记材料和信号放大系统，使得检测灵敏度大大提高，多数免疫分析方法不仅可以达到定性分析要求，还可以进行半定量以及定量分析。还有部分方法不需要标记物即可进行高灵敏的快速检测，如免疫传感器中的电化学传感器和表面等离子共振传感器，都是目前研究的热点。

然而免疫分析技术的发展还存在着一些局限性和瓶颈，如ELISA需要较长的孵育时间，免疫试纸条的准确性和灵敏度偏低，目前仍多用于半定量或定性检测[55]。而高灵敏度和高通量的新型方法功能强大、检测快速，但样品中复杂的基质干扰问题影响着免疫方法的开发，前期需投入大量精力，对分析方法进行针对性地开发，实验消耗较大，如化学发光免疫分析中发光剂的选择和制备、免疫芯片的集成和制备，表面等离子共振免疫传感器的制备，大量的抗原抗体消耗等[31,66,76]，使得优越的功能和经济成本仍难以兼顾，尚需进一步改善。

目前免疫分析新方法的研究更多的是追求更高的灵敏度和便携性，研究和制备过程投入大、成本高，多数研究对方法的抗干扰性和实际样品检测方面的探索较为薄弱，若要真正应用于不同种类的基质检测仍需加强前期基础研究工作。

4.2 免疫分析方法在农药残留检测中的应用前景

免疫分析技术的应用领域逐渐广泛，在农药残留分析方面已有出色的成绩，并主要应用于食品以及环境样品中农药残留的分析检测，且对有机磷类农药的研究较多，其次为氨基甲酸酯类，其他类型农药的研究相对较少。目前免疫分析方法正向着多元化发展，其在实验室和市场检测方面具有较大的潜力。超高的灵敏度是目前新型免疫方法的发展趋势，然而，在进行实际检测时，方法的稳定性以及对检测对象的通用性同样重要。

中药基质不同于水样和食品基质，其成分相对复杂，往往含有皂苷、萜类、黄酮类、色素等组分，加之中药材炮制过程中可能产生新的成分，产生基质干扰的可能性更大。复杂的基质对于抗原抗体反应体系以及最后的信号检测等过程都有很大影响，这对免疫分析技术的开发是一个挑战。样品的前处理是目前解决中药材基质干扰问题的主要手段，同时，随着免疫分析技术的发展，多种免疫分析技术灵敏度的提高，使得检测样品可以根据农药限量标准进行更大倍数的稀释，以降低基质干扰[83]。免疫分析技术正不断地向着更加快速、高效、高灵敏的方向发展，有望为中药材中的农药残留检测提供更多手段。