减压提取与常压提取柴胡挥发油品质比较

薄福民，张 丽，孙 越，杨山景，封安杰，李凌军

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

柴胡为伞形科植物柴胡BupleurumChinenseDC.或狭叶柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根[1]，主产于我国西北和华北地区，具有疏肝解郁、升举阳气、解热等功效[2]。其主要成分为柴胡皂苷、挥发油、多糖、黄酮类等[3-4]，柴胡皂苷类与挥发油是其主要发挥药效物质[5]。现代药理学研究表明，柴胡挥发油具有解热、镇痛、抗炎和抗惊厥等作用，解热作用强，且用量少[6]，广泛用于临床及制备解热药(如柴胡注射剂等)。由于柴胡挥发油主要为小分子物质，常温下性质不稳定，易挥发，高温易氧化，因此不同方法提取的柴胡挥发油品质存在一定差异。

目前，柴胡挥发油提取方法有水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、压榨法、超临界流体提取法、微波提取法和超声提取法等[7]。由于柴胡药材中挥发油含量低且水溶性大，工业方法多采用传统的水蒸气蒸馏法，该法虽操作简单、成本低廉，但由于挥发油长时间接触高温水，其中热不稳定成分易受热分解，从而影响挥发油品质，进而影响临床药效。因此，优选柴胡挥发油的提取技术，对于提高挥发油的品质具有重要的研究意义。减压提取是近年发展起来的较为新颖的一种提取技术，它通过调控真空度降低溶剂沸点，保持溶剂低温沸腾状态，动态提取挥发油，可有效减少热敏性成分的破坏，提高有效成分的提取效率[8]，改善挥发油品质。故本文通过对比两批北柴胡在减压和常压条件下提取的挥发油成分、含量及其药效，为优选柴胡挥发油的提取工艺研究提供数据参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

SC 920G无线遥控真空泵系统(青岛浩赛科技股份有限公司)；7890A/5973N气相色谱-质谱联用仪、6890N气相色谱仪(美国安捷伦公司)；MS205DU/A天平(十万分之一，上海屹利科学仪器有限公司)；正己烷(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)；两批北柴胡药材均产自山西运城，分别购于安徽九合堂国药有限公司(柴胡A，批号：20200401)和亳州中强中药饮片有限公司(柴胡B，批号：191101)。

1.2 溶液配制

内标溶液：精密称取莰烯9.73 mg于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配成0.973 mg/mL的内标溶液，备用。

标准溶液：精密称取正己醛16.04 mg、庚醛15.70 mg、正辛醛13.30 mg和反式-2,4-癸二烯醛14.44 mg于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，分别配成质量浓度依次为1.604、1.570、1.330、1.444 mg/mL的对照品溶液，备用。

柴胡挥发油供试品溶液：取柴胡药材100 g，加1 000 mL水，采用水蒸气蒸馏法提取1 h得蒸馏液，用40 mL正己烷萃取，萃取液经无水硫酸钠脱水，过滤，通风自然挥干至5 mL。精密加入0.4 mL内标溶液(莰烯)，混匀，定容至10 mL，过0.22 μm微孔滤膜后即得供试品溶液。

柴胡挥发油样品液：精密称取北柴胡药材2份，每份100 g，加入1 000 mL水，连接真空泵系统，分别常压(1.0×105Pa)和减压(0.85×105Pa，蒸馏温度为91～92 ℃)提取1 h得蒸馏液，再用40 mL正己烷萃取。萃取液经无水硫酸钠脱水、抽滤，重复4次，通风自然挥干至5 mL，过0.22 μm微孔滤膜后即得样品液。

1.3 气相色谱-质谱条件

色谱条件：采用HP-5毛细管色谱柱(0.25 mm×15 m，0.25 μm)；载气为氦气(He)，流量1 mL/min；分流进样，分流比15∶1，进样量1 μL；进样口温度250 ℃；柱升温程序：初温50 ℃，以2 ℃/min升至70 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，总分析时间42 min。

质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，连接器温度280 ℃，溶剂延迟2 min；质量扫描范围m/z33～550，电子倍增器电压为1 435 V。检索谱库为NIST17.L,利用色谱峰面积归一化法进行相对定量。

1.4 气相色谱条件

HP-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温：初温50 ℃，以2 ℃/min 升至70 ℃，再以10 ℃/min升至220 ℃；流速1.0 mL/min，进样量1.0 μL，分流比15∶1。气化室温度250 ℃，检测器(FID)温度250 ℃。

1.5 药效学实验

1.5.1 药物制备分别于常压(1.0×105Pa)和减压(0.85×105Pa)条件下提取北柴胡挥发油蒸馏液，用正己烷萃取后脱水浓缩制得精油，备用。实验时按剂量溶于1%的吐温80(无菌生理盐水配制)给药。

1.5.2 分组、造模与给药SD(Sprague dawley)大鼠，雄性，体质量为220～240 g，实验前适应环境3 d，期间早晚各测1次肛温，第4 d开始实验，给药前12 h禁食不禁水，当日先测2次大鼠肛温，选取2次测量温差在0.5 ℃内的大鼠，取其平均值为基础体温。随机选取6只作为空白对照组，背部皮下注射生理盐水(5 mL/kg)，其余大鼠注射15%酵母混悬液(5 mL/kg)，致热4 h后测定大鼠体温，温度升高0.8 ℃为造模成功。将造模成功的大鼠按照体温升高值随机分为模型对照组、常压提取挥发油组、减压提取挥发油组3组，每组6只。减压提取挥发油组和常压提取挥发油组于致热后4 h和7 h腹腔注射给药，每次精油给药剂量为0.05 mL/kg。

两批北柴胡提取的挥发油分别按上述处理进行解热实验，并于造模4 h后每小时测定大鼠体温一次，直至各组大鼠体温恢复正常。

2 结果与讨论

2.1 提取设备的选择

实验中减压提取采用可远程无线控制的SC 920G真空泵系统(可达到2×102Pa高真空)，该系统可设置固定压力值，控制提取环境的真空度，从而达到减压提取的目的，且设备在提取过程中压力稳定，适用于减压提取柴胡挥发油。实验前期发现，压力为1.0×105Pa和0.85×105Pa提取的柴胡挥发油中指标成分的提取率和相对含量均较高，而在0.5×105Pa压力下提取时则较低，推测是由于此压力下提取温度相对低，醛类物质提取不完全所致，经优化后选择0.85×105Pa作为减压提取的压力参数。

2.2 GC-MS鉴定结果与分析

取购自安徽九合堂国药有限公司(柴胡A)和亳州中强公司(柴胡B)的北柴胡药材，按照“1.2”方法制成样品液，分别经常压(1.0×105Pa)和减压(0.85×105Pa)提取后采用GC-MS分析，再通过NIST17.L谱库检索对样品成分进行解析，并利用面积归一化法计算各成分的相对含量，结果见表1。

表1 柴胡挥发油成分及相对含量Table 1 Composition and relative content of essential oil from Bupleurum Chinense (%)

(续表1)

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由表1数据可见，减压(0.85×105Pa)和常压(1.0×105Pa)提取的柴胡A分别分离鉴定出37、34种挥发油成分(色谱图见图1)，其中壬醛、4-萜烯醇和肉豆蔻醚仅存在减压提取的挥发油中；柴胡B分别鉴定出33、35种挥发油成分，常压提取的挥发油中无甲酸辛酯、马兜铃酮，但存在2，4-二甲基庚烷、庚醇、戊基环戊环烯酮和异戊二烯氧化物-(1) 4种成分。两种压力下提取的柴胡挥发油存在成分差异，推测是由于常压提取过程中成分发生氧化水解反应，而减压提取时可有效防止该反应的发生[8]，并且减压提取时由于温度低，可保护柴胡挥发油中部分热敏性成分免受破坏，有效防止了在提取过程中挥发油的变质，因此改善了挥发油的品质。

两批北柴胡提取的挥发油中己醛、庚醛、正辛醛和反式-2，4-癸二烯醛含量均较高，这些成分具有解热抗炎等作用[9-12]，可能为柴胡挥发油的有效成分，故将其作为考察柴胡挥发油品质的指标成分。结果显示：柴胡A在不同压力提取时，挥发油中此4种成分的相对含量差异较小。柴胡B在减压提取时，反式-2，4-癸二烯醛的相对含量(9.73%)略低于常压提取(10.96%)，但己醛、庚醛和正辛醛的相对含量(分别为21.28%、11.46%、4.57%)显著高于常压提取(分别为15.92%、8.88%、3.75%)，表明柴胡B在减压条件下提取的挥发油中药效成分相对含量高，更适用于制剂和临床。因此，相比常压提取，减压提取可防止部分成分受破坏和提高有效成分的相对含量，对两批药材中的挥发油品质有着不同程度的改善。

图1 常压(A)和减压(B)提取柴胡A挥发油的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of volatile oil extracted from the Bupleurum A by atmospheric pressure(A) and decompression conditions(B) the peak numbers 1-52 are the same as those inTable 1

2.3 GC法考察挥发油成分含量

2.3.1 方法学考察精密吸取己醛、庚醛、正辛醛、反式-2，4-癸二烯醛对照品溶液0.05、0.2、0.4、0.6、1.0 mL，加入内标溶液0.2 mL，用正己烷定容至5 mL，制成5个不同浓度的对照品与内标混合溶液，在“1.4”条件下测定，以各化合物的质量浓度(X)为横坐标，对应峰面积与内标峰面积之比(Y)为纵坐标绘制标准曲线。结果显示：4种化合物在一定浓度范围内线性良好，相关系数为0.999 4～0.999 9。取12份已知含量的柴胡样品，按指标成分分为4组，每组分别精密加入低、中、高3个浓度的标准溶液，按照“1.2”方法提取制备柴胡挥发油加标供试品溶液，在优化条件下测定，得4种指标成分的平均回收率为97.4%～99.2%，相对标准偏差(RSD)为2.5%～3.3%，表明方法的精密度及重复性良好。

2.3.2 样品测定称取柴胡A、B药材各两份，每份100 g，连接真空控制系统，按“1.2”方法分别进行常压(1.0×105Pa)、减压(0.85×105Pa，蒸馏温度为91～92 ℃)提取，得4份供试品溶液，再用GC法测定己醛、庚醛、正辛醛和反式-2，4-癸二烯醛的含量，结果见表2。结果显示，两批北柴胡药材在减压提取时，己醛、庚醛、正辛醛和反式-2，4-癸二烯醛的提取量均高于常压提取，表明减压提取可以提高有效成分的提取率，这也较好地解决柴胡原料利用率低的问题。

表2 柴胡挥发油成分含量Table 2 Contents of essential oil of Bupleurum Chinense m/mg

2.4 柴胡挥发油对发热大鼠的解热作用

2.4.1 发热模型的选择干酵母发热模型是通过引起注射部位的局部急性炎症，导致出现全身性发热反应，是最常用的发热模型之一[13]，其致热成分主要为全菌及荚膜多糖、蛋白质，发热初起可见短暂性体温降低，之后体温旋即升高，至体温高峰阶段进入平台期，维持数小时后体温回落，对解热效果探索的相关实验具有独特优势[14]，是评价中药提取物以及中药复方解热作用最常用的模型[15]。因此本研究采用干酵母诱导大鼠发热模型，模型热势相对较高且持久，适合考察柴胡挥发油的解热作用。

2.4.2 统计学方法选择本实验按随机化原则将受试大鼠随机分配到不同水平组，各组接受不同的处理，通过比较单个处理因素各个水平组间的均数差异有无统计学意义来分析处理因素的效应。这种设计仅涉及一个处理因素，但该因素有两个或多个水平，因此又称为单因素方差分析。实验数据采用SPSS统计软件进行处理，计算每只动物各时间点体温与致热前基础体温的差值作为体温增高值，各组体温增高值数据均以“均数±标准差”表示，用单因素方差分析进行组间比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.4.3 实验结果与分析两批柴胡的解热实验结果见表3，与空白组相比，模型组在致热5～11 h内体温升高显著(P<0.01)，表明造模成功；常压给药组与减压给药组大鼠在致热5～10 h内解热作用明显，说明常压提取和减压提取的柴胡挥发油均具有较强的解热作用。在致热10 h时，柴胡A采用减压提取的挥发油解热效果(P<0.01)与常压提取的挥发油解热效果(P<0.05)具有显著性差异(P<0.01)，柴胡B采用减压提取的挥发油解热效果(P<0.01)比常压提取(P<0.05)更为显著，表明两批柴胡在减压条件下提取的挥发油解热药效均优于常压提取。

表3 柴胡挥发油对发热大鼠模型体温的影响Table 3 Effect of volatile oil from Bupleurum Chinense on body temperature of febrile rat model

3 结 论

本实验采用GC-MS法分析了北柴胡在不同压力下提取的挥发油成分及其相对含量，采用GC法建立了己醛、庚醛、正辛醛和反式-2，4-癸二烯醛的含量测定方法，测定不同压力下挥发油成分的提取效率，并制备干酵母发热大鼠模型考察了不同压力下提取的柴胡挥发油解热效果。结果表明，减压提取能有效减少热敏性成分被破坏，提高有效成分的提取效率，提取的柴胡挥发油具有更显著的药效，品质优于常压提取。同时，减压提取可有效解决柴胡原料利用率低的问题，因此是一种较为理想的柴胡挥发油提取技术。