银莱汤中主要成分的UPLC多波长宽动态测定及质量评价研究

郁映婷，刘 洁，白 辰，赵淑军，杨 洁，吴 浩， 潘绮雪，刘铁钢*，肖红斌*

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 100029；2.北京中医药大学 中医药研究院，北京 100029；3.北京中医药 大学 中药分析与转化研究中心，北京 100029；4.北京中医药大学 中医学院，北京 100029； 5.新疆石河子大学 药学院，新疆 石河子 832002)

银莱汤是在经典名方银翘散与保和丸的基础上，结合北京中医药大学谷晓红教授的临床用药经验，形成的以肺胃同治为主要治则的临床经验方[1]。其由金银花、莱菔子、连翘、黄芩、鱼腥草、瓜蒌、前胡组成，功效为清肺泻胃、宣肺止咳、辛凉清解、调和表里，临床用于治疗肺胃积热型感冒患儿。银莱汤能够明显改善患儿机体状态，减少发病次数，总有效率可达95%[2]。药理研究表明，银莱汤有显著的解热抗炎作用[3]，能有效治疗食积复合流感病毒感染小鼠肺部的炎症损伤[4]，能通过促进免疫球蛋白的分泌、调控细胞因子之间的网络平衡来增强机体黏膜免疫功能[5-7]，进而发挥其抗流感病毒的功效。银莱汤目前处于中药新药研发阶段，其药理功效基本明确，然而尚未建立质量控制方法。

中药复方成分具有复杂性，是君臣佐使多味药材中多种化学成分的集合。中药复方发挥药效是由其中的一类或几类成分协同起效，活性成分含量变化直接影响其质量和药效[8-11]，因此建立综合、全面的质量控制方法十分必要。目前，常以单一指标性成分控制中药复方制剂的质量，不足以评价中药复方的整体质量[12]。近年来，有较多学者采用多成分含量测定来控制中药复方的质量，然而大部分研究仅测定中药复方中的君药和臣药中活性成分或某一类成分的含量，忽视了佐使药材，造成复方中部分药材活性成分的遗漏，特征性较差[13-14]。基于此，本研究选择银莱汤的君(金银花、莱菔子)、臣(连翘、瓜蒌)、佐(鱼腥草)、使(黄芩、前胡)药材中药典指标性成分和响应值较强的成分，以及复方中发挥清热解毒、抗菌抗炎功效的成分进行测定，以期综合、全面地控制银莱汤的质量。

相较单成分测定，多成分测定由于复方中各成分的紫外吸收及含量差异大，在同一波长下难以实现同时测定，若选用多个波长进行检测，则需调用不同色谱图进行数据处理，图谱结果分析较繁琐[15]。因此，本研究采用超高效液相色谱(UPLC)波长在线切换法建立同时测定银莱汤中10种有效成分含量的方法，并测定3个批次中各成分含量用于质量稳定性、一致性评价，从而为该中药复方的质量评价提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

安捷伦1290超高效液相色谱仪，配G4212A型DAD紫外检测器、G1316C型柱温室、G4226A型自动进样器、G4220A型二元泵(美国Agilent公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AT201型1/10万电子天平(瑞士梅特勒公司)；N-1300旋转蒸发仪(日本EYELA公司)；BZF-50真空干燥箱(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)；MC268C恒温恒湿电子防潮箱(莱茵迈瑞欧工业科技有限公司)；超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试剂与材料

乙腈、甲酸、甲醇(色谱纯，美国Sigma公司)；超纯水为实验室自制。

对照品(纯度大于98%)：新绿原酸(X-014-180410)、绿原酸(L-007-171216)、隐绿原酸(Y-067-181216)、芥子碱硫氰酸盐(J-043-180413)、连翘酯苷A(L-012-181216)、槲皮苷(H-011-180506)、黄芩苷(H-016-180322)、汉黄芩苷(H-019-180823)、千层纸素A苷(Q-046-181013)均购自成都瑞芬思生物科技有限公司;连翘酯苷I(FY3876B0516)购自南通飞宇生物科技有限公司。

金银花(产地：山东，批号：1901024)、炒莱菔子(产地：河北，批号：1812077)、连翘(产地：山西，批号：1903063)、黄芩(产地：河北，批号：1901040)、干鱼腥草(产地：湖北，批号：1811006)、瓜蒌(产地：江苏，批号：1812065)、前胡(产地：浙江，批号：1811059)均购自北京太洋树康药业有限责任公司，由北京中医药大学王学勇教授鉴定，存储于北京中医药大学中药分析与转化中心实验室。

1.3 实验方法

1.3.1 银莱汤干膏粉的制备按照处方称取金银花30 g、炒莱菔子10 g、连翘15 g、鱼腥草20 g、黄芩10 g、前胡10 g、瓜蒌15 g，置于5 000 mL圆底烧瓶中，加入10倍量水，加热回流提取1.5 h，重复提取3次，放冷过滤。合并3次滤液，减压浓缩干燥至小体积，再经减压干燥箱干燥后，制成粉末，保存于恒温恒湿电子防潮箱。

1.3.2 混合对照品溶液的制备分别称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芥子碱硫氰酸盐、连翘酯苷I、连翘酯苷A、槲皮苷、黄芩苷、千层纸素A苷、汉黄芩苷适量，精密称定，加甲醇配成质量浓度分别为50.0、50.0、50.0、25.0、20.0、16.7、5.00、500、125、100 μg·mL-1的混合对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备取“1.3.1”银莱汤干膏粉0.2 g，精密称定，加适量50%甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶中，再加50%甲醇稀释至刻度，使用前过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液即得。

1.3.4 色谱条件色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈。梯度洗脱：0～5 min，10%～15% B；5～10 min，15% B；10～16 min，15%～25% B；16～30 min，25%～32% B。柱温为30 ℃，进样体积为2 μL，流速为0.4 mL·min-1。采用波长切换：0～10 min，在320 nm波长下测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芥子碱硫氰酸盐、连翘酯苷I；10～16 min，在350 nm波长下测定连翘酯苷A、槲皮苷；16～30 min，在320 nm波长下测定黄芩苷、千层纸素A苷和汉黄芩苷。

2 结果与讨论

2.1 检测成分的选择

在检测成分的选择上，应综合考虑银莱汤复方君臣佐使药材中的指标性成分和响应值较强的成分，以及复方中发挥清热解毒、抗菌抗炎功效的成分。复方君药金银花中的酚酸类成分是清热解毒的主要药效物质，且新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸在金银花中含量较高，其中绿原酸为指标性成分[16-17]；君药莱菔子的主要活性成分为芥子碱，以芥子碱硫氰酸盐的形式存在，常作为莱菔子的质控指标成分[18]；臣药连翘含有木脂素类、苯乙醇苷类、挥发油等多种成分，其中连翘酯苷类是主要的特征活性成分，具有显著的抗菌、抗炎作用[19-21]，且连翘酯苷A为指标性成分；佐药鱼腥草中的槲皮苷等黄酮类化合物具有较强的肺部炎症治疗活性[22-23]，其中槲皮苷被用于质量控制[24]；使药黄芩的活性成分为黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A苷等黄酮类化合物，是发挥抗炎、抗病毒的主要药效物质[25-26]，其中黄芩苷为指标性成分。目前，2015版《中国药典》暂未确定瓜蒌的指标性成分[12]；前胡的主要成分为脂溶性的香豆素类化合物[27]，但在水煎液中溶出较少，且前胡在银莱汤复方中用量较小，因此未选择瓜蒌和前胡中成分进行测定。综上，本研究选择新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芥子碱硫氰酸盐、连翘酯苷I、连翘酯苷A、槲皮苷、黄芩苷、千层纸素A苷、汉黄芩苷为检测成分。

2.2 样品复溶溶剂的选择

分别考察了水、50%甲醇、甲醇作为复溶溶剂的效果。结果表明，加水复溶后，溶液中杂质较多导致过滤困难，放置一段时间后样品瓶底部有沉淀析出，影响测定；以甲醇复溶时，进样检测后发现色谱峰峰形不对称，出现峰分叉现象，可能由于样品溶剂强度大于流动相而出现了溶剂效应；50%甲醇对样品有较好的溶解，并可减少杂质干扰。因此，最终选择以50%甲醇作为样品的复溶溶剂。

2.3 检测波长的选择

通过对10个成分的混合对照品溶液进行紫外吸收全波长扫描，发现新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芥子碱硫氰酸盐、连翘酯苷I、连翘酯苷A在326 nm波长下有最大吸收，槲皮苷在255、350 nm波长下有最大吸收，黄芩苷、千层纸素A苷、汉黄芩苷在275 nm波长下有最大吸收。但黄芩苷类成分在275 nm波长下吸收强，吸光度过高，在同一色谱图中与其他待测成分的色谱峰峰高比例不协调，因此选择有较强吸收的320 nm波长作为待测成分的主要检测波长。根据化合物的保留时间，最终确定的检测波长切换程序如“1.3.4”所示。

由于复方中各成分的紫外吸收及含量差异大，若仅以某一单波长作为多成分的检测波长，易遗漏复方中关键成分的信号。本实验发现芥子碱硫氰酸盐、连翘酯苷I在275 nm波长下信号较弱，无法准确定量；而在本实验选定的3个波长中，槲皮苷仅在350 nm波长下有吸收。此外，对各成分的峰面积进行分析发现，绿原酸类和黄芩苷类成分在其最大吸收波长处的吸光度较高，与其他成分的峰高比例不协调，这对多成分同时定量的线性范围确定带来一定困难。基于此，本实验针对吸收强的成分选择有相对较强吸收的波长，对信号响应弱的成分选择最大吸收波长进行在线切换动态检测。综上，相较单波长检测，本实验采用的波长在线切换动态检测不仅能够对不同成分进行同时测定，而且可兼顾所有成分吸光度值在合理的线性范围内，可为中药复方多成分同时测定提供参考。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性精密吸取混合对照品、供试品溶液2 μL，按照“1.3.4”色谱条件进行分析，结果见图1。供试品与对照品中10种成分均在相同保留时间处出峰，且达到基线分离。

2.4.2 线性关系分别精密吸取适量“1.3.2”的混合对照品溶液，加甲醇稀释，得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的质量浓度为0.781、1.56、3.13、6.25、12.5、25.0、50.0 μg·mL-1；芥子碱硫氰酸盐的质量浓度为0.391、0.781、1.56、3.13、6.25、12.5、25.0 μg·mL-1；连翘酯苷I的质量浓度为0.313、0.625、1.25、2.50、5.00、10.0、20.0 μg·mL-1；连翘酯苷A的质量浓度为0.261、0.521、1.04、2.08、4.17、8.34、16.7 μg·mL-1；槲皮苷的质量浓度为0.078 1、0.156、0.313、0.625、1.25、2.50、5.00 μg·mL-1；黄芩苷的质量浓度为7.81、15.6、31.3、62.5、125、250、500 μg·mL-1；千层纸素A苷的质量浓度为1.96、3.91、7.81、15.6、31.3、62.5、125 μg·mL-1；汉黄芩苷的质量浓度为1.56、3.13、6.25、12.5、25.0、50.0、100 μg·mL-1的系列对照品混合溶液。取上述溶液各2 μL，按“1.3.4”色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标(Y)，对照品的质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数(r)。结果表明，各成分在相应质量浓度范围内线性关系良好，r不小于0.999 2(见表1)。

表1 各成分的线性关系、检出限与定量下限Table 1 Linear relationships,LODs and LOQs of various components

2.4.3 检出限与定量下限取“1.3.2”配制的混合对照品溶液，逐级稀释，按“1.3.4”色谱条件进样测定，分别以信噪比(S/N)为3和10时对应的质量浓度作为检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，测得10种有效成分的LOD为0.018 8～0.075 0 μg·mL-1，LOQ为0.062 5～0.250 μg·mL-1(见表1)。

2.4.4 精密度取同一对照品溶液，按“1.3.4”色谱条件连续进样6次，分别计算峰面积。结果显示，10种有效成分峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.040%～0.65%，表明仪器精密度良好。

2.4.5 稳定性取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h精密吸取2 μL，按“1.3.4”色谱条件进样测定。结果表明，10种有效成分峰面积的RSD为0.35%～1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.6 重复性按照“1.3.3”方法平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取2 μL，按“1.3.4”色谱条件进行测定。结果表明，10种有效成分含量的RSD为0.52%～1.5%，表明该方法重复性良好。

2.4.7 加标回收率取6份已知各成分含量的银莱汤干膏粉样品0.1 g，精密称定，加入10种有效成分对照品适量，按“1.3.3”方法制备供试品溶液，在“1.3.4”色谱条件下进行测定，计算各成分的平均回收率和RSD(见表2)。结果表明，10种成分的平均回收率为95.1%～104%，RSD为0.80%～3.7%，方法准确度良好。

2.5 样品含量测定

取3批银莱汤干膏粉样品，按照“1.3.3”制备供试品溶液，以“1.3.4”色谱条件进样分析，得到10种成分的含量。由3批样品中各化合物的平均含量明确化合物在银莱汤中的含量分布(见图2A)，同时计算3批样品中化合物总含量的RSD及各化合物含量的RSD，明确化合物在不同批次中的稳定性(见图2B)。

结果表明，10种有效成分的总含量达70.013 mg·g-1，3个批次银莱汤中10种有效成分总含量的RSD为0.75%，各化合物含量的RSD均小于9.0%，表明不同批次银莱汤的质量较为稳定；君药金银花和莱菔子，臣药连翘，佐药鱼腥草及使药黄芩中所测成分的含量分别占10种成分总量的22%、5%、73%，表明复方中除君药外，其他各药材活性成分也起着重要作用，因此评价银莱汤质量时应综合考虑。

本实验测得10种成分的平均含量为0.204～38.129 mg·g-1，可见银莱汤中有效成分的含量范围跨度较大。其中以黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A苷的含量最高(均达6.172 mg·g-1以上)，其次为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸(均达3.875 mg·g-1以上)，芥子碱硫氰酸盐、连翘酯苷I、连翘酯苷A的含量较低(达1.493 mg·g-1以上)，以上成分较全面地涵盖了复方中君臣佐使药材的特征性成分，且批间含量差异相对较小(RSD依次为0.86%、0.98%、0.53%、1.3%、0.61%、1.2%、0.37%、0.75%、2.9%)，表明以上成分在不同批次银莱汤中能够稳定存在。槲皮苷的含量最低(为0.204 mg·g-1)，且在不同批次银莱汤中含量的稳定性稍差(RSD为8.1%)，因此槲皮苷不宜作为银莱汤的质量评价指标。

此外，黄芩苷、绿原酸可通过影响炎症信号通路而发挥解热镇痛、抗炎作用，且具有广谱抗菌、抗病毒作用[28-29]；汉黄芩苷可通过MLCK/pMLC2通路改善肠上皮屏障功能以减轻结肠炎[30];新绿原酸可作为AMPK/Nrf2信号激活剂，防止与急性和慢性炎症性疾病相关的巨噬细胞介导的过度反应[31];隐绿原酸可通过调节NF-κB/MAPK信号级联和Nrf2核易位来减轻炎症损伤和抗氧化应激[32];芥子碱硫氰酸盐是莱菔子中抗菌、促进胃肠运动的主要药效物质[33]；连翘中的连翘酯苷类活性成分与其发挥清热解毒作用密切相关[34]。综上所述，黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芥子碱硫氰酸盐、连翘酯苷I、连翘酯苷A 9个成分不仅是与复方清热解毒、抗菌抗炎密切相关的功效成分，且覆盖了复方中多个关键药材，同时在复方中能够稳定存在，可作为银莱汤的质量评价指标。

3 结 论

本研究建立了银莱汤中主要成分的多波长宽动态UPLC测定方法，该方法简便可靠、分析效率高，测定指标相对全面、合理可行，能更好表征及控制银莱汤的质量。并筛选得到黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芥子碱硫氰酸盐、连翘酯苷I、连翘酯苷A 9个成分可作为银莱汤复方的质量评价指标，从而综合全面地评价银莱汤的质量。