CD14启动子-159位点基因多态性与中国朝鲜族2型糖尿病足患者足背动脉硬化相关性研究

Amit Sinha 金香子 于婕 郑寿焕 金光明

[摘要] 目的 研究CD14基因-159位点基因多态性与中国朝鲜族2型糖尿病足患者（DF）足背动脉硬化（FDA）的关联性。 方法 选取2018年10月至2020年5月在延边大学附屬医院内分泌科及手足外科住院的朝鲜族DF患者286例，彩色多普勒超声观察患者FDA情况，将存在FDA的患者分为无溃疡组（NFDAU组）和有溃疡组（FDAU组），记录全部2型糖尿病（Type 2 diabetic mellitus，T2DM）患者血液生化指标。同时，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术对所有DF患者的CD14基因-159位点进行基因型分析。 结果 无溃疡组和有溃疡组CD14基因-159位点上，各基因型及等位基因频率比较，差异无统计学意义（χ2=1.801，P>0.05;χ2=1.864，P>0.05）;CC基因与CT及TT基因基因频率比较，差异有统计学意义（χ2=0.009，P<0.05）;NFDAU组和FDAU组在病程、吸烟饮酒、高血糖及高尿酸指标方面比较，差异有统计学意义（P<0.05）;Logistic回归分析显示，病程、吸烟饮酒及C等位基因均与FDAU相关联（P<0.05）。 结论 CD14基因-159位点基因多态性与中国朝鲜族DF并发FDA相关，其中CC纯合子基因是DF患者并发FDAU的遗传学风险因素。病程、吸烟、饮酒及C等位基因是FDAU的危险因素。

[关键词] CD14基因-159位点;基因多态性;2型糖尿病足;足背动脉硬化;溃疡;彩色多普勒超声

[中图分类号] R575.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）33-0006-05

[Abstract] Objective To study the association between gene polymorphism of -159 locus in CD14 gene promoter and foot dorsal arteriosclerosis （FDA） in Chinese Korean type 2 diabetic foot patients （DF）. Methods A total of 286 Korean DF patients hospitalized in the Department of Endocrinology and Department of Hand and Foot Surgery in Yanbian University Hospital from October 2018 to May 2020 were selected. The FDA status of the patients was observed using color Doppler ultrasound. The patients with FDA were classified as the non-ulcer group（NFDAU） and the ulcer group （FDAU）. All biochemical blood indicators of type 2 diabetic mellitus （T2DM） patients were recorded. At the same time， the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism technique was used to perform genotype analysis on the-159 locus of CD14 gene in all DF patients. Results There was no statistically significant difference in the genotypes and allele frequencies at-159 locus of CD14 gene between the non-ulcer group（NFDAU） and the ulcer group （FDAU） （χ2=1.801， P>0.05; χ2=1.864， P>0.05）. The gene frequency difference between CC， CT and TT genes was statistically significant （χ2=0.009， P<0.05）.There were significant differences in disease course， smoking and drinking， hyperglycemia，and hyperuric acid indicators between NFDAU and FDAU（P<0.05）.Logistic regression analysis showed that the course of disease， smoking and drinking， and C allele were all associated with FDAU（P<0.05）. Conclusion The polymorphism of 159 locus of CD14 gene is associated with FDA in Chinese Koreans with DF. The CC homozygous gene is a genetic risk factor for DF patients with FDAU. The course of disease， smoking， drinking and C allele are risk factors for FDAU.

[Key words] 159 Locus in CD14 gene; Gene polymorphism; Type 2 diabetic foot; Foot dorsal arteriosclerosis; Ulcer; Color Doppler ultrasound

糖尿病足（Diabetic feet，DF）是糖尿病所有并发症中最为严重、凶险的类型，可引起患者截肢、残疾，重者可导致下肢坏疽、感染、甚至病死。DF包括以下两个阶段，即糖尿病周围神经病变（Diabetic peripheral neuropathy，DPN）及足背动脉硬化（Foot dorsal arteriosclerosis，FDA），两者相互关联、互相演进，直接导致患者生存质量严重下降，并威胁患者生命。然而，目前临床对其尚缺乏有效的治疗手段。因此，越来越多的观点认为在DF发病前采取早期干预和治疗意义重大[1]。多年来，本课题组一直从事CD14基因-159位点基因多态性与2型糖尿病（Type 2 diabetic mellitus，T2DM）患者血管病变相关性的研究，本研究发现该基因多态性与T2DM患者颈动脉粥样硬化斑块形成、左心室肥厚密切相关，且-159位点的基因突变可引起T2DM患者微血管血流动力学发生变化，最终导致视网膜中央动脉、肾动脉发生一系列病变[2-4]，但目前国际和国内关于其与足背动脉硬化关联的研究较少，这也为本研究提供了进一步研究的空间和思路。

边疆少数民族人民的身体健康一直是党和国家关心的重要问题，在地域和风俗因素影响下，朝鲜族人民具有喜饮酒、喜高盐饮食等习惯，而以上均被认为是糖尿病血管并发症的危险因素。为此，笔者进行了本研究，旨在为边疆地区朝鲜族DF患者提供一些发病危险因素及临床预警信息，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年10月至2020年5月在我院内分泌科及手足外科住院的朝鲜族DF患者286例，所有患者均为T2DM患者，T2DM诊断根据2019年WHO公布的最新诊断标准[5]。并排除具有如下任一种情况者：继发性高血压、冠心病、恶性肿瘤、免疫系统疾病及因药物导致的肝肾功能异常。其中男168例，女118例，平均年龄（54.23±9.68）歲。需要指出的是，本研究意在从早期对DF患者进行预防，因此筛选的患者只包含Wagner分级[6]中的0～3级患者，严重的合并周围神经病变的患者未纳入其中。所采用糖尿病足的诊断标准：①符合糖尿病诊断;②具有下肢缺血的临床表现，具体表现为下肢皮温下降、皮肤苍白、伴有麻木酸痛感及出现间歇性跛行症状;③彩色多普勒超声检测出现足背动脉斑块形成、管腔狭窄甚至闭塞。最终筛选出FDA患者244例，其中无溃疡组（Non-foot dorsal arteriosclerosis ulcer，NFDAU）患者184例，有溃疡组（Foot dorsal arteriosclerosis ulcer，FDAU）患者60例。本研究经延边大学附属医院医学伦理委员会批准，所有参加研究的患者均签署知情同意书并知晓研究内容。

1.2 方法

1.2.1 临床指标  所有患者年龄、性别、吸烟及饮酒等自然信息，根据WHO的标准化建议，吸烟人群的定义标准为“每周吸烟>4次，总量≥6支”;饮酒人群的定义标准为“平均摄入酒精量>30 g/d，持续时间≥半年”[7]。测量血压、病程、身体质量指数（Body mass index，BMI），抽取肘静脉血进行生化检测，项目含空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）、三酰甘油（Triglyceddes，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、C-反应蛋白（C reactive protein，CRP）、糖化血红蛋白（Glycatized hemoglobin，HbAlc）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）、尿酸（Uric acid，UA）等。

1.2.2 彩色多普勒超声检查足背动脉  患者行彩色多普勒超声检查前禁烟及禁酒48 h，采用坐位检查，使用东芝S2000彩色多普勒超声诊断仪，线阵探头频率为5～7.5 MHz，触及足背动脉搏动感时，将探头沿血管走行纵切探查，不要用力压迫血管，测量足背动脉内中膜厚度（Intima-media thickness，IMT），当IMT≥1 mm时可诊断为DFA[8]。

1.3 患者DNA的提取

根据WizardR Genomic DNA Purification Kit （Pro-mega公司）说明书步骤提取DNA。上游引物为：5-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3，下游引物为：5-GTGCCAACAGATGAGGTTCAC-3。扩增完成后，以Ava Ⅱ限制性内切酶对扩增产物进行酶切反应，之后进行电泳，在2%琼脂糖凝胶上出现基因条带后进行基因型的判读，记录所有患者基因型。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，评估等位基因及基因频率利用χ2检验。Logistic回归分析评价各风险因素及C、T等位基因突变与FDAU的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 彩色多普勒超声检查FDA声像图

根据彩超声像图（图1A）中，可见足背动脉前壁上多个强回声斑块形成，但动脉管腔未见狭窄，血流通畅;图1B可见足背动脉后壁上弱回声斑块形成，造成此处动脉管腔狭窄，血流束变细;图1C可见足背内部充满弱回声，管腔内未见血流信号，提示足背动脉闭塞。

2.2 CD14基因-159位点基基因型测序

经检验，CD14基因-159位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，等位基因频率在不同种族人群中的分布亦符合Hardy-Weinberg平衡定律。见图2。

2.3 CD14基因-159位点基因型

CD14 PCR扩增产物经酶切后基因型有3种，CC型（497 bp），CT型（497、353、l44 bp），TT型（353、144 bp）。见图3。

2.4 NFDAU组和FDAU组CD14基因-159位点基因型和等位基因频率比较

根据彩超结果及肉眼观察患者足背表皮情况，将DF患者分为有溃疡组（FDAU组）和无溃疡组（NFDAU组）。CD14基因-159位点基因多态性在朝鲜族正常对照组和朝鲜族DN患者中的分布比较，差异无统计学意义（χ2=1.801，P>0.05）;等位基因频率在两组人群中的分布比较，差异无统计学意义（χ2=1.864，P>0.05）。见表1。

2.5 NFDAU组和FDAU组CD14基因-159位点CT+TT基因型和CC基因频率比较

将CD14-159位点CC纯合子与CT杂合子+TT纯合子基因频率比较，差异有统计学意义（χ2=0.009，P<0.05）。见表2。

2.6 自然信息與临床生化指标的比较

FDAU组与NFDAU组年龄、吸烟、饮酒、病程、FBG、HbAlc和CRP比较，差异有统计学意义（P<0.05）;其余各项比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.7 FDAU危险因素的Logistic回归分析

将FDA患者视为一个队列人群，以发生FDAU与否为因变量，将所有临床资料和生化指标以及是否存在C-1591T突变为自变量，进行Logistic回归分析。病程、吸烟和饮酒是FDAU的独立危险因素，而C等位基因突变是FDAU的风险因素，存在C突变的DF患者合并FDAU风险增高。见表4。

3 讨论

袭龙祥等[8-9]研究发现，约1/6的T2DM患者最终会发生DF，DF发病的典型“三联征”包括神经异常、动脉异常及肌肉挛缩，而三者中最主要的病因就是足背动脉硬化（FDA）引发的动脉管腔狭窄及堵塞，导致足部局部组织缺血缺氧，出现炎症反应，一旦发生感染，后果极为严重，甚至会发展成为坏疽[10-11]。

T2DM患者一般首先出现双下肢深动脉及浅动脉血管的缺血性病变，当病变发展到一定程度时，则会累及足部，发生缺血性溃疡，即糖尿病足溃疡（FDAU），由于足部动脉位于人体供血末端，因此具有反复发作、难以愈合、迁延不愈等特点。本课题组前期研究显示，CD14基因-159位点基因多态性与中国朝鲜族T2DM患者下肢动脉硬化相关，其机制主要有以下几点：CD14主要表达在单核巨噬细胞表面，通过刺激单核-巨噬细胞系统（Mononuclearphagocyte system，MPS）释放多种炎症细胞因子，加速蛋白质糖化产物的形成，并导致其在血管内堆积，引起血管平滑肌细胞增生和内中膜增厚;其次通过合成胶原蛋白Ⅲ[12]或直接作用于管壁细胞，增加血管细胞外基质，引起纤维组织增生及钙质沉着，使内中膜增厚、血栓形成，最终导致动脉硬化及硬化斑块的形成[13]，而足背动脉是下肢动脉在足部的延续，因此该基因多态性与DFAU的关系不难理解。

国内一些学者发现，感觉神经肽物质（Substance P，SP）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）与FDAU的发生呈负相关[14]。Park等[15]利用SP对糖尿病大鼠FDAU模型进行治疗后发现，溃疡面的愈合效果有明显提升。而本研究的CD14基因-159位点C-T的基因突变过程中，引起组氨酸转变为酪氨酸的变化，此过程会导致SP和VEGF表达大幅降低，最终可导致溃疡面的愈合不良，因此反向证明此基因突变与FDAU的关系。

研究发现一氧化氮（Nitricoxide，NO）在整个炎症溃疡的发生、发展及修复过程中，均发挥着重要作用[16]。CD14基因-159位点基因突变后会降低氧化酶的活性，导致动脉血管细胞的凋亡、一氧化氮（NO）的合成减少及各种炎症因子大量释放[17]，而FDAU究其根本是一种炎症反应，因此两者之间必然存在着较为密切的关联性。

有关年龄、病程、FBG和HbAlc与FDAU存在相关性的机制比较容易理解，T2DM病程长者，其难以控制的高血糖及糖代谢紊乱会导致晚期糖基化终末产物（Advancd glyca-sylation end products，AGEs）在血管中大量蓄积，可引起皮肤、皮下组织及血管的多种损害;另外，持续的高糖状态为细菌提供了在皮肤创面大量滋生、繁殖的温床，以上均可引起局部的感染破溃、甚至坏疽[18]。

除了病理生理方面的原因，种族文化、生存地域、生活习惯的不同也越来越被认为是T2DM发病的重要病因，我国的朝鲜族主要聚集在我国东北部，民俗开朗、能歌善舞，有着悠久的饮酒传统，甚至形成了一种“饮酒文化”。朝鲜族的饮酒文化可以说是深入到百姓的日常生活当中，是朝鲜族在适应东北地区寒冷生态环境，克服困难，憧憬美好生活的一种乐观精神的反映。曾有调查研究显示，朝鲜族人均每日酒精摄入量达到70～80 g，远远高于国际上推荐的不超过30 g的标准。酒类中D-氨基酸（D-amino acids，DAA）代谢会导致尿酸大量生成，高尿酸血症可引发炎症递质释放、动脉脂质过氧化而引起动脉硬化[19]。此外，朝鲜族在饮酒时，喜欢佐食高盐、高糖食物，因而DF的发病风险明显上升。烟草中的尼古丁、焦油吸收到人体后，其产生的氧自由基等物质进入血管可导致血管壁弹性下降，最终导致动脉硬化及DF等疾病的发生[20-21]。

综上所述，笔者认为CD14基因-159位点基因多态性与中国朝鲜族FDAU患者存在相关性，其纯合子CC基因性可能是FDAU独立的危险因素。年龄、病程、FBG、CRP和HbA1c均可被视为FDAU发病的危险因素。希望通过本研究可指导糖尿病患者早期预防DF的发生，并为患者从基因水平筛查DF提供更好的依据。

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（收稿日期：2021-03-17）