大孔树脂纯化薜荔茎总黄酮的工艺研究

王晓华 韦汉燕 桂劲松 韦巧慧

桂林医学院，广西 桂林 541199

薜荔(FicuspumilaL.)来源于桑科榕属[1],主要分布在广西、湖南、四川等省区，其有相当膨大的成熟花托，像无花果，俗称“鬼球、鬼馒头”，最早于明朝的《本草纲目》中记载。薜荔在我国药用历史悠久，根、茎、叶和果实为药用部位，具有祛风除湿、固肾填精、活血通络、消炎解毒、抗菌、增强免疫力、抗肿瘤、抗感染、消炎镇痛、驱虫等作用[2]。近年研究结果显示，薜荔植株的各部位均含有黄酮类物质，尤以茎部含量丰富。黄酮类化合物是一类有抗氧化作用的化合物，其生理活性强，能抗动脉硬化，降低胆固醇，抗痉挛、抗辐射[3]。薜荔植株中的黄酮含量颇高，具有很高的开发利用价值，但目前缺乏对薜荔茎中黄酮类成分的研究。本实验选择AB-8大孔吸附树脂，通过静态吸附和动态解吸试验，筛选出薜荔茎总黄酮纯化的最佳工艺条件，为薜荔茎总黄酮的开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 材料 薜荔茎药材，购自广西桂林中草药批发市场,经桂林医学院王晓华副教授鉴定为桑科榕属薜荔FicuspumilaLinn的干燥茎；芦丁对照品(中国药品生物制品鉴定所)；亚硝酸钠(AR 汕头市西陇化工股份有限公司，批号：130902)；九水合硝酸铝(AR 汕头市西陇化工股份有限公司，批号：140304)；氢氧化钠(AR 武汉宏大化学试剂厂)；AB-8型大孔树脂(天津市海光化工有限公司)。

1.2 主要仪器 CP225D电子分析天平；SHZ-B水浴恒温振荡器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；UV-1600PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；SHB-IIIT循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；RE-5203旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

2 方法与结果

2.1 薜荔茎总黄酮的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10.05 mg干燥至恒重，置于50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液溶解，稀释至刻度，摇匀，即浓度为0.201 mg/mL溶液。

2.1.2 最大吸收波长的确定 准确吸取芦丁对照品溶液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入5%的亚硝酸钠溶液1.0 mL将其振荡后静置6 min，加入1.0 mL的10%硝酸铝溶液，将其振荡放置6 min后加入4.0 mL的4%氢氧化钠溶液，最后用70%乙醇溶液调至刻度线[4]，振匀放置15 min显色。以不含对照品溶液的相应试剂作为空白对照，测定200～800 nm 扫描波长范围内的吸光度，得到最大吸收波长为503 nm。因此，以503 nm作为测量波长。

2.1.3 线性关系的确定 准确吸取芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL容量瓶中，照“2.1.2”项下方法，以对照品溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，测定503 nm处的吸光度，得到标准曲线：A=10.382 C+0.0034(r=0.9993)，结果如图1所示。芦丁浓度为0～0.0482 mg/mL时线性关系较好。

2.1.4 薜荔茎提取液的制备 将薜荔茎药材粉碎，过80目筛。取100 g薜荔茎粉末，置2000 mL圆底烧瓶中，加入十倍量70%乙醇浸渍30 min,装上冷凝回流装置，加热回流提取共3次，每次1 h，趁热抽滤[5]，最后用旋转蒸发仪减压浓缩至浓度为1 g生药材/mL薜荔茎提取液，作为样品溶液。

2.1.5 薜荔茎总黄酮的含量测定 精密吸取1.0 mL薜荔茎提取液，用70%乙醇稀释至10 mL，摇匀，再从中吸取0.5 mL放置于25 mL容量瓶中。然后按“2.1.2”项下方法加入显色试剂，以70%乙醇和相应的显色剂为空白,测定503 nm处的吸光度值,并根据回归方程计算总黄酮含量[6]。得薜荔茎总黄酮含量为6.25 mg/mL。

2.2 大孔树脂的预处理 取适量的AB-8大孔树脂置于烧杯中，用适量95%酒精浸渍AB-8大孔树脂24 h, 使其充分膨胀后采取湿法进行装柱,用95%酒精动态冲洗树脂,再用蒸馏水将树脂冲洗直到嗅不到酒精味；将5%盐酸加到柱子里浸泡树脂2 h后用蒸馏水动态冲洗树脂使洗脱液的pH值呈中性, 然后将5% NaOH溶液加到柱子中浸泡树脂2 h后用蒸馏水动态冲洗树脂至洗脱液呈中性；用95% 乙醇冲洗树脂使洗脱液与水混合(1∶5)至无白浊现象产生, 最后用蒸馏水冲洗树脂至洗脱液无酒精味, 留着备用[7]。

2.3 AB-8树脂吸附因素的考察

2.3.1 AB-8大孔吸附树脂静态吸附和静态解吸实验

2.3.1.1 静态吸附 准确称取经过处理的2.0 g(湿质量) AB-8大孔树脂放入50 mL具塞三角烧瓶中，加入30 mL薜荔茎提取液(1 g生药材/mL)。将塞子盖紧并于37℃水浴中振荡12 h。取上清液测定吸光度。根据标准曲线方程计算总黄酮的浓度，得出静态吸附率和吸附容量。 吸附量Q=(C0-Cr)V/W。在公式中,Q是吸附量(mg·g-1树脂), C0是初始质量浓度 (mg/mL),Cr是吸附后的黄酮含量 (mg/mL),V是溶液的体积 (mL), W是树脂的质量(g)。吸附率=(吸附前黄酮含量/吸附后黄酮含量)/吸附前黄酮含量×100%。

由表1可知，树脂静态吸附量为50.03 mg/g，吸附率为53.36%。

表1 薜荔茎总黄酮在AB-8大孔树脂的吸附量

2.3.1.2 静态解吸 将已静态吸附的饱和大孔树脂用蒸馏水冲洗到洗脱液呈无色。然后加入70%乙醇30 mL并在37℃水浴振荡器上摇动12 h解吸。解吸后，通过吸取上清液测定吸光度。根据标准曲线方程计算总黄酮的浓度，得出静态解吸率。解吸率D(%)=(V×Cr)/(W×D)×%。式中：Q为吸附量(mg·g-树脂)；Cr为解吸后溶液中黄酮的含量(mg/mL)；V是溶液的体积(mL)；W为树脂的质量(g)。由表2可知，静态解吸后的解吸率为84.61%。

表2 薜荔茎总黄酮的洗脱率

2.3.1.3 静态吸附动力学研究 称量2.0 g(湿质量)已处理过的树脂置于50 mL的带塞三角瓶中，再加入30 mL浓度为1 g生药材/mL的薜荔茎提取液，在恒温器 37℃处晃动2 h, 每1 h吸收一次上清液, 并测定吸光度值。以标准曲线方程确定总黄酮浓度及吸附率, 将时间作为横向坐标, 吸附率为纵向坐标,绘制动力学曲线。从图2结果可以看出， AB-8大孔树脂对薜荔茎总黄酮的吸附是一种快速平衡型吸附，随着吸附时间的增加，吸附速率在3 h内迅速下降，4 h后吸附速率稳定，吸附平衡基本达到。因此，吸附时间被确定为4 h。薜荔茎总黄酮的富集纯化使用AB-8大孔树脂适宜。

2.3.2 吸附条件的考察

2.3.2.1 样品液的质量浓度的影响 分别加入70%的乙醇溶液稀释已制得的薜荔茎1 g生药材/mL浓度的提取液，得到质量浓度分别为0.25、0.50、0.75 g生药材/mL的样品液。称量4份已预处理过的 AB-8大孔树脂，每2.0 g(湿质量)为一份于50 mL的具塞三角瓶中，分别加入质量浓度为0.25、0.50、0.75 g生药材/mL的样品液30 mL，在恒温水浴振动筛上于37℃放置4 h，然后取上清液测量吸光度，得出总黄酮的浓度与吸附率。由表3可以看出，当该样品液浓度为0.5 g生药材/mL时，薜荔茎总黄酮的吸附率最佳，因此选择0.5 g生药材/mL作为样品液的质量浓度。

2.3.2.2 pH值的影响 称取5份已预处理的AB-8大孔树脂，每2.0 g(湿质量)为1份，把它们分别放进一个50 mL的锥形瓶里，将浓度为1 g生药材/mL的提取液30 mL加入瓶中， pH调节至3、4、5、6、7在37℃下振荡3 h。测量吸光度，计算得出总黄酮的浓度与吸附率。从表4可以看出，当pH在3 ～ 6范围时，AB-8大孔树脂对薜荔茎总黄酮具有较好的吸附率，当吸附介质pH值为7时，吸附率明显提高， 因此，吸附剂的pH值调到7最优。

表3 不同的提取液浓度对AB-8大孔树脂吸附容量的影响

表4 PH值对AB-8大孔树脂的吸附量影响

2.3.2.3 泄漏曲线的绘制与上样量的确定 准确称取5.0 g经过预处理的AB-8大孔树脂，湿法装柱，取0.5 g生药材/mL浓度(pH调为7)的薜荔茎提取液，样品流速为1 mL/min, 每10 mL收集1个样品, 收集18份样品,测定吸光度值并计算总黄酮的浓度, 将药物溶液体积作为横坐标，将未吸附率绘制在纵坐标上以确定样品上柱体积。未吸附率=流出液中成分含量/上柱前原液中流出物含量。图3结果显示,上样量达140 mL时发生明显泄漏，树脂柱不能完全吸附药液中的黄酮成分,所以上样量为140 mL时更合理,故确定140 mL(14 BV)作为最大上样量。

2.3.3 洗脱条件的考察

2.3.3.1 洗脱剂体积分数的影响 取5份已预处理的AB-8大孔树脂，分别放到50 mL的具塞三角瓶中，并加入0.5 g生药材/mL(pH=7)薜荔茎提取液适量使其吸附达到饱和，再加入不同体积分数的洗脱剂30 mL(50%、60%、70%、80%、90%乙醇)，放置于37℃的恒温水浴中于振荡器摇动4 h，取其上清液，以吸光度值来计算解吸速率。从表5可以看出，当乙醇的体积分数小于70%时，解吸首先下降然后上升，然后缓慢上升。因此，选取的洗脱剂为70%乙醇。

表5 不同乙醇浓度的影响

2.3.3.2 确定洗脱剂的用量 准确称量5.0 g的AB-8大孔树脂，湿法装柱。取140 mL浓度为0.5 g生药材/mL(pH调至7)的薜荔茎提取液，流速为1 mL/min上样。用5倍柱体积(5BV)的纯水冲洗树脂除去杂质，用70%乙醇以1.0 mL/min的流速洗脱至洗脱液呈无色，收集10 mL/份的洗脱液来测定吸光度。用于计算总黄酮含量。以总洗脱量为纵坐标 (mg) ，洗脱量 (mL)为横坐标，得到动态洗脱曲线。 总洗脱量(mg)=Cd2×Vd2。式中，流出物的总黄酮质量浓度为Cd2，洗脱剂体积为Vd2。从图4可以看出，当洗脱液为80 mL(约8BV)时，茎中的总黄酮已被完全洗脱，因此选择8BV作为洗脱剂的量。

2.4 工艺验证试验 对上述所得到的最优工艺条件进行3次重复试验验证，计算大孔树脂富集纯化后薜荔中总黄酮的质量分数。经过3次验证试验，从表6可知大孔树脂富集纯化后的薜荔茎总黄酮的质量分数分别为65.04%、63.56%、64.37%，平均质量分数是64.32%，其结果表明，AB-8大孔树脂对薜荔茎总黄酮的富集纯化过程是稳定可行的。

根据上述实验的结果，确定了薜荔茎总黄酮的纯化工艺条件是：取薜荔茎提取液(0.5 g生药材/mL)，药液 pH=7，上样量14 BV，以1 mL/mL的速度通过 AB-8大孔吸附树脂柱，静置4 h，再用5 BV的蒸馏水来冲洗水溶性杂质，用8 BV 70%乙醇以1 mL/min的速度洗脱大孔树脂，将洗脱液减压浓缩。回收溶剂，烘干并干燥，得样品。

表6 薜荔茎总黄酮的质量分数

3 讨论

AB-8型大孔吸附树脂是一种具有极大比表面积、合适孔径的球形弱极性聚合物吸附树脂，它可通过表面吸附、氢键等作用于黄酮类化合物，是黄酮类化合物的优良吸附剂。本实验从静态吸附和动态解吸两个方面对AB-8大孔吸附树脂分离纯化薜荔茎总黄酮的工艺条件进行了研究。结果表明: 样品液的浓度、pH值、样品体积、静态吸附时间、乙醇体积分数、洗脱剂用量对薜荔茎总黄酮的吸附量和洗脱率影响较大。当乙醇的浓度小于70%时，解吸率呈先下降后上升再缓慢增长趋势。从实验结果可以看出，可选择70% ～ 90% 的乙醇体积分数来洗脱。由于考虑到实验室的经济效益方面，本实验以70%乙醇作为洗脱液浓度。实验结果显示，50.03 mg/g为AB-8型大孔吸附树脂对薜荔茎总黄酮静态的吸附量，而84.61%是解吸附率，呈现出其具备较好的分离纯化能力。最优的吸附工艺条件是:取薜荔茎提取液(0.5 g生药材/mL)，药液 pH=7，上样量14 BV，以1 mL/mL的速度通过 AB-8大孔吸附树脂柱，静置4 h，再用5 BV蒸馏水来冲洗水溶性杂质，用8 BV 70%乙醇以1 mL/min的速度洗脱大孔树脂，其洗脱液用旋转蒸发仪进行减压浓缩回收乙醇，干燥后得到红褐色膏状物。该工艺简单易操作，无污染，树脂可再生，生产效率高，具有一定的推广应用价值。