HPLC法测定野蚕豆根中桃叶珊瑚苷含量的研究

吴银双 李 莉 单 蕊 陈 燕 杜 冰 李海宁 姚 政*

1.云南省药物研究所，云南 昆明 650111；2.云南中医药大学，云南 昆明 650500；3.重庆市开州区中医院，重庆 405400

野蚕豆根，又名化血丹、小红药、金猫头(广西)、灵芝草(云南) ，原植物来源于玄参科( Scrophulariaceae) 胡麻草属( Centranthera) 植物大花胡麻草CentrantheragrandifloraBenth，主要分布于云南、贵州、广西等地， 越南、缅甸、印度也有分布[1]。以根入药，主要载于《中华本草》《全国中草药汇编》《天然药8404种诠释》《云南中草药》《中国民族药志要》《红河天然药物》等书，具有消肿止痛、散瘀止血的功效,外用治外伤出血[2]。在云南省红河州等地，野蚕豆根主要被用于防治多种心脑血管疾病，且疗效显著，系当地苗族地区名贵地方药。迄今为止，有关野蚕豆根的主要化学成分研究报道，主要含有环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、类胡萝卜素类、紫罗兰酮苷类、单萜苷类等丰富的生物活性物质[3-5]。其中环烯醚萜苷类化合物是其主要化学成分，环烯醚萜苷具有抗炎、抗肿瘤、保肝、降糖、神经系统保护作用等广泛的药理活性[6-7]，最新的研究还发现环烯醚萜苷类具有DNA合成酶抑制剂的作用，可开发成抑制DNA合成的抗肿瘤新药[5]。桃叶珊瑚苷是野蚕豆根中含量最高的环烯醚萜苷类成分[3]。桃叶珊瑚苷在抗氧化、抗炎、抗菌、抗糖尿病、保肝、抗肿瘤、神经保护及促进伤口愈合作用等功效显著[8]，能明显抑制乙型肝炎病毒DNA的复制和促进干细胞再生[9]。药理研究显示，野蚕豆根用药安全，无明显毒性反应，有抗凝血及抗炎活性[10-11]，对心血管疾病和大鼠急性缺血模型所到处心肌损伤有保护作用[12-13]，泡制的酒可以防治脑血栓、脑梗[14]。该民族药疗效确切，有较好的应用前景。目前，随着野蚕豆根临床需求量的增加，其野生资源已属濒危，当地已开展人工种植。

有关HPLC法测定野蚕豆根中桃叶珊瑚苷的含量，张传利等[15-16]对其野生(根、茎、叶、花)、栽培的野蚕豆根不同部位(根、茎、叶、花、混合样)的桃叶珊瑚苷、梓醇进行含量了测定，野生的野蚕豆根桃叶珊瑚苷的含量高低为：根>茎>花>叶，根的含量远高于其他部位；栽培的野蚕豆根桃叶珊瑚苷的含量高低为：根>叶>混合样>茎>花，根中的最高含量为0.930 mg/g；两种野蚕豆根中梓醇在叶中含量都是最高的。色谱柱：Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙晴-水(3∶97)，检测波长205 nm。本研究对栽培野蚕豆根1年生根、茎叶；2年生根、茎叶中的桃叶珊瑚苷分别进行含量的测定，色谱柱：XBridge Shield C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(2∶98)，检测波长203 nm。建立HPLC法测定野蚕豆根中桃叶珊瑚苷含量的方法，为栽培野蚕豆根药材质量评价及采收的合理性提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e695型高效液相色谱仪、万分之一电子天平(恒平,FA2004型)、十万分之一电子天平(岛津,SHIMADZU)、超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司,SK3300LH)、万能高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司,DFY-C)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂,RE-2000A)、电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司,DZKW-D-4)、循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司,SHZ-ⅢA)。

1.2 试剂 桃叶珊瑚苷对照品购自中国食品药品检定研究院(批号：111761-200601)。所用试剂均为分析纯，使用娃哈哈纯净水，甲醇为色谱醇。野蚕豆根采自云南省红河州屏边县国云种植有限公司栽培基地，经云南中医药大学李海宁老师鉴定为玄参科胡麻草属植物大花胡麻草CentrantheragrandifloraBenth.的根及根茎。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取桃叶珊瑚苷对照品6.20 mg，置50/mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成0.124 mg/mL对照品溶液，避光冰箱保存，备用。

2.2 供试品溶液的制备[17]分别精密称取1年生根、茎叶、2年生根、2年生茎叶(1.0 g)，置于具塞锥形瓶中，加氯仿20 mL，超声处理20 min，滤过。药渣自然晾干后，加60%乙醇30 mL，称定质量，超声处理30 min，再称定质量，用60%乙醇补足损失的质量，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 色谱条件及适用性实验[18-19]色谱柱：XBridge Shield C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)；梯度洗脱程序：0～25 min 2%～98% B；25～30 min 80%～20% B；30～35 min 2%～98% B；流速1.0 mL/min，检测波长203 nm，柱温30℃，进样量：20 μL。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液2 μL，注入液相色谱仪。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.1”对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL分别置于10 mL容量瓶中，依次稀释定容，分别进样20 μL，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得线性回归方程为：Y=6326522.085X-1747.411(R=0.9990)，线性范围为：12.8～74.4 μg/mL。

2.5 精密度实验 取“2.1”对照品溶液适量，按“2.3”色谱条件重复进样6次，每次20 μL，记录色谱图，按峰面积计算相对偏差。桃叶珊瑚苷对照品的相对标准偏差(RSD)为1.44%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 取“2.2”供试品溶液，按“2.3”色谱条件，精密吸取同一供试品溶液20 μL，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，其相对标准偏差(RSD)为1.92%，表明供试品溶液在24 h内表现出良好的稳定性。

2.7 重复性实验 精密称取6份药材，按“2.2”制备供试液，按“2.3”色谱条件分别进样测定，每次20 μL，记录色谱图，按峰面积计算相对偏差。其相对标准偏差(RSD)为1.21%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验 精密称取9份已知含量的野蚕豆根药材粉末，每份0.50 g，按“2.2”制备供试液，分别精密加入一定量的对照品溶液，按“2.3”项色谱条件测峰面积，计算回收率，结果显示桃叶珊瑚苷的平均回收率为100.98%，RSD=0.695%。

表1 加样回收试验结果

2.9 供试品含量测定 分别取野蚕豆根(1年生根茎、茎叶；2年生根茎、茎叶)粗粉适量，平行称取6份，按“2.2”制备供试液，按“2.3”色谱条件进样测定，记录峰面积，采用Excel 2010处理计算桃叶珊瑚苷的含量。

表2 各种样品里桃叶珊瑚苷的所含的量 (n=6)

3 讨论

野蚕豆根主要化学成分为环烯醚萜苷类化合物，其中含量最高的桃叶珊瑚苷,也是其中的活性成分之一，是评价野蚕豆根质量标准的一个重要指标。本研究以桃叶珊瑚苷为测定指标，采用流动相甲醇-水溶液(2∶98)梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长203 nm的色谱条件，从而研究野蚕豆根中桃叶珊瑚苷的含量。实验结果表明在此条件下峰形对称性较高，无拖尾现象，测得含量稳定，重现性好，为野蚕豆根的开发与应用提供实验依据，同时也为其它药材测定桃叶珊瑚苷化合物提供参考。

野蚕豆根在云南省红河州一带资源丰富，被当地苗族广泛用于心血管系统疾病的防治，由于大量采集，现野生资源枯歇，目前在云南省红河州已经开展了大量人工种植，由于3年生野蚕豆根多发生根的腐败而导致产量降低，故一般采收1～2年生药材。本研究以桃叶珊瑚苷的含量为评价指标，对栽培野蚕豆根1年生、2年生根以及地上部份茎叶进行含量测定，桃叶珊瑚苷2年生根、1年生根、2年生茎叶、1年生茎叶的平均含量分别为：2.4815%、0.9759%、0.3758%、0.0266%。

2年生根、茎叶的桃叶珊瑚苷含量远远高于1年生根、茎叶的含量，为野蚕豆根药材2年采收的合理性提供理论依据。

野蚕豆根主要化学成分是环烯醚萜苷类化合物，环烯醚萜苷类化合物在自然界中分布广泛，是具有多种药理活性的天然产物，有很高的药用价值，其根中的桃叶珊瑚苷是含量最高的化合物。近代研究，野蚕豆根泡制的酒可以防治脑血栓、脑梗[14]，也明确了野蚕豆根作为防治心脑血管疾病候选新药的开发价值，根作为原料还可以在新型药物、抗肿瘤、保健食品、化妆品的添加剂等开发方面具有广阔的前景。