加味匀气熏洗颗粒薄层色谱鉴别研究

李文静 王继永 潘 旭 刘 军 赛纪虎

银川市中医医院，宁夏 银川 750001

加味匀气熏洗颗粒处方为我院协定处方,由干姜、白芷、川芎、零陵香、红花等十味药组成，有芳香健脾益肾、化瘀通络之功效，主用于脾肾两虚夹瘀、寒凝血瘀引起的糖尿病性周围神经病变(DPN)、风湿骨痛等[1-2]。全方体现用“香”特色，采用芳香药物进行淋浴、洗浴，药液通过熏蒸的方法，使药物有效成分穿过皮肤角质和表皮扩散、吸收，使脉络组织代谢通畅，充分发挥宁夏地方特色及中医药优势，为DPN治疗寻求一种安全方便、价廉效佳的外治手段。目前临床上多结合熏蒸针刺等疗法进行治疗且取得较好疗效，但该临方加工品种原剂型为粗粉，工艺较为落后，且缺乏质量控制标准。为了加快科技成果转化和有效控制并改善其制剂质量，本研究对原工艺进行改进将其制备为颗粒剂，并对处方中至少1/3药味进行TLC鉴别，旨在将其开发为医院中药制剂，扩充其使用范围。

1 仪器与试药

XA105电子天平；ZF1紫外分析仪(上海耶茂有限公司)；硅胶G板、H板(青岛海洋化工厂分厂+烟台市化学工业研究所)，对照药材均从中国食品药品检定所购买，其中川芎对照药材(120918-201411)；红花对照药材(120907-201412)；干姜对照药材(120942-201309)；白芷对照药材(120945-201309)；加味匀气熏洗颗粒为我院制剂中心自制(20180705、20180706、20180708)；水是蒸馏水，其他试剂都是分析纯。

2 方法与结果

2.1 白芷TLC鉴别 取三批次本品各2 g，加20 mL石油醚(60～90 ℃)，超声15 min，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为样品溶液，另取对照药材，同法制成对照药材溶液并依照加味匀气颗粒处方制备工艺单剂量同法制成缺白芷的阴性对照液；参照药典通则0502项下实验，各吸取上述溶液10 μL，分别点于G板，用石油醚(60～90 ℃)-乙醚(3∶2)层析缸内使展开[3]，取出，晾干，置254 nm的紫外灯下检视[4]。样品色谱与对照药材色谱主斑点位置统一，分离较好且阴性无干扰。如图1所示。

2.2 干姜TLC鉴别 取三批次本品各5 g，加水50 mL，加热回流30 min，滤过，滤液浓缩至约20 mL，放冷，用等体积乙酸乙酯连续萃取2次，合并上层乙酸乙酯液，蒸干，加乙醇1 mL使残渣复溶，作为供试品溶液[5]。另取干姜对照药材同法制成对照药材溶液并照加味匀气颗粒处方制备工艺单剂量同法制成缺干姜阴性溶液。照薄层色谱法(通则0502)实验，各吸取上述溶液5 μL，分点于同一硅胶G板，以石油醚(60～90℃)-氯仿-乙酸乙酯(2∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷适量2%香草醛硫酸溶液，105℃加热，直到斑点清晰，在日光下检视[6]。样品色谱与对照药材色谱主斑点位置统一，分离良好且阴性无干扰。如图2所示。

2.3 川芎TLC鉴别 取三批次本品各1.4 g，加石油醚(60～90℃)20 mL，超声15 min，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液，另取川芎对照药材，同法制成对照药材溶液且依照加味匀气颗粒处方制备工艺单剂量制同法得缺川芎的阴性对照溶液[7]。照薄层色谱法(通则0502)实验，各吸取上述溶液5 μL，分点于同一硅胶G板上，用甲苯-乙酸乙酯(3∶1)在层析缸内展开[8]，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。样品色谱与对照药材色谱主斑点位置统一且清晰，分离较好且阴性无干扰。如图3所示。

2.4 红花TLC鉴别 取三批次本品各2 g，加80%丙酮20 mL，密塞，超声30 min(40HZ)，静置后过滤，取5 mL浓缩至1 mL，作为供试品溶液[9]；另取红花对照药材，同法制成对照药材溶液且按照加味匀气颗粒处方制备工艺单剂量同法制缺红花阴性溶液。参照药典通则0502实验，各吸取上述溶液10 μL，分别点于同一硅胶H板，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(35∶10∶10∶2)为展开剂[10-11]，展开，取出，晾干。样品色谱与对照药材色谱中主斑点颜色及位置统一，分离较好。如图4所示。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性考察 分别吸取白芷、红花、川芎、干姜四味药供试品溶液(批号：20180705、20180707、20180708)与对应对照药材溶液和阴性品溶液，按其拟定的相应方法试验。结果均未见阴性对照有干扰(如图1～4所示)。

2.5.2 耐用性考察

2.5.2.1 不同厂家薄层板的比较 取青岛海洋化工厂分厂及烟台市化学工业研究所生产的薄层板(G、H)，分别按四味药拟定的方法试验。结果无明显差别。

2.5.2.2 不同温度的比较 取点样后的薄层板，分别在6℃和30℃中展开，结果表明在6～30℃范围内试验，对四味药的鉴别均无明显的影响。

2.5.2.3 不同相对湿度的比较 取点样后的薄层板，分别在不同湿度的层析缸中展开，按拟定的方法试验。其中38%、80%硫酸水溶液分别放置层析缸一侧(约5～6 mL以不溢至另一侧为准)饱和30 min后，另一侧倒入展开剂，放入点好的薄层板。结果表明在相对湿度38%～80%之间试验，对四味药鉴别均无明显的影响。

3 讨论

3.1 工艺改进方面 加味匀气熏蒸颗粒处方是在我院党毓起主任团队结合多年临床经验组成的协定方(加味匀气散)基础上进行工艺改进而来，组成有肉桂、干姜、炒桃仁、红花、零陵香、地椒、白芷、川芎等，重用活血通络、化瘀止痛药物，有效改善局部组织细胞的通透性，以增强微循环血流，促进药物吸收，从而达到改善DPN引起的凉、麻、瘙痒、疼痛等不适，更重要的是可保护局部神经损伤，具有止痛，尚能促进病变组织修复。采用湿法制粒将原散剂改进为颗粒剂并使用热封型茶叶滤纸袋包装，方便临床熏蒸治疗，且生产工艺简单，药味简价廉，安全无创，易于DPN患者所接受，使内病外治，由表及里，舒筋通络，使发汗不伤营卫，生产条件要求相对低，符合医院制剂开发现状。

3.2 鉴别药味的选择方面 本研究也曾对方中君药肉桂、臣药桃仁等进行薄层鉴别方法建立，但因阴性干扰严重未作为质控标准。白芷、川芎、红花、干姜的TLC鉴别实验均先参照药典方法进行考察，除干姜外，展开剂或提取溶液等根据情况有所变动及调整。

3.3 川芎及白芷TLC建立 ①样品前处理方面：药典中白芷及川芎饮片在薄层鉴别制备样品液时均先用乙醚浸泡振摇提取，滤液挥干后乙酸乙酯复溶；由于白芷和川芎的乙醚提取液在紫外灯下斑点均不明显，为提高提取效率，最终选择极性相似的石油醚超声提取制备供试品溶液，结果斑点清晰度增强，得到明显改善。②展开剂方面：川芎在以正己烷-乙酸乙酯(3:1)为展开剂[12]时，阴性干扰严重；以石油醚(60℃)-乙酸乙酯(4∶1)，主斑点RF值偏低，阴性有干扰；结合文献屡次试验后川芎以甲苯-乙酸乙酯(3∶1)为展开剂。③薄层板选择：实验发现该制剂中川芎参照药典使用GF254点板后，斑点不清晰。后使用硅胶G板在254 nm下红花色谱造成的红色背景消失，主斑点清晰，故最终选用硅胶G板。

3.4 红花TLC建立 以药典展开剂乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)展开后，RF值过大，不在0.2～0.8之间，故将水的比例降低，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(35∶10∶10∶2)为展开剂展开后RF值=0.68，3批样品液图谱与红花对照药材图谱上红色主斑点位置一致，斑点清晰且阴性无干扰。

目前该协定处方已完成稳定性考察，拟近期备案为医疗机构中药制剂从而服务更多DPN患者，扩展其使用范围。