乌头碱下调miR-23a诱导凋亡抑制胃腺癌细胞系MGC803增殖

汝 晶 陈 嵘 郑 梅 李明泓 张 珊

云南中医药大学基础医学院，云南 昆明 650500

胃癌是一种在全球范围内预后差、致死率高的恶性消化系统肿瘤，大约90%的胃部肿瘤都属于腺瘤[1]。一般认为外科手术是对其进行根治的唯一疗法，同时辅以放化疗。然而，由于早期胃癌的诊断率低，大多数患者发现就是进展期或晚期，错过最佳的手术窗口期，增加胃癌的致死率[2]。目前在临床上主要使用卡培他滨、顺铂、氟尿嘧啶等在内的化疗药物进行联合治疗。但化疗药物副作用明显，且长期使用会损害机体的多个器官系统[3]。中药具有良好的抗肿瘤活性，且毒副作用小。生物碱类是中药有效成分中的重要组成之一，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等多种生物活性[4]。乌头碱(aconitine)是存在于川乌、草乌、附子等药用植物的一种生物碱。传统中医理论认为，乌头类中药具有回阳救逆、温阳散寒等疗效；近些年临床应用和实验研究表明，其在抗肿瘤、强心、镇痛、调节免疫等方面具有特殊的功效。

乌头碱对包括胃癌在内的多种恶心肿瘤都具有抑制肿瘤细胞增殖以及侵袭的作用[5-6]。将乌头碱注射液稀释后接种胃癌FC的615纯系小鼠，结果显示实验组瘤重抑制率显著高于对照组[7]；王冠庭[8]发现以乌头碱注射液治疗晚期胃癌患者，3个疗程后，患者症状改善，梗阻症状消失。然而目前乌头碱在临床上的应用却受到限制，一方面是由于其使用剂量及毒性；另一方面则是其抗肿瘤作用机制的研究还十分有限。

miR-23a是定位于人19号染色体的一种非编码微小RNA，与胃癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展相关，被视为一个癌基因[9-11]。利用生物信息学方法(综合TargetScan、MirBase两个网站信息)预测出IRF1为miR-23a的可能靶基因，且已知报道miR-23a在胃腺癌组织中高表达，并通过下调其下游靶蛋白干扰素调节因子1(IRF1)参与调节胃腺癌细胞的增殖[12-13]，两者之间的靶定关系在肝癌细胞中也同样存在[14]。而乌头碱的抑癌作用是否与参与调节miR-23a及其通路相关，这一点仍需进一步研究。本研究在细胞及分子水平，使用乌头碱对细胞进行处理，通过观察细胞增殖与凋亡情况，检测目标基因及靶蛋白水平的变化，探讨乌头碱抗肿瘤作用miRNA水平的机制，为临床上合理应用乌头碱治疗胃癌提供相关的实验基础与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 乌头碱(批号BBP03866，云南西力生物有限公司)：取乌头碱20.3 mg，加入1.015 mL三氯甲烷，配制成20 mg/mL的母液，然后按一定的比例分别稀释成浓度为0、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL的稀释液备用；三氯甲烷(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)；MTT(SIGMA,美国)；DMSO(SIGMA,美国)结晶紫(SIGMA,美国); 4%多聚甲醛(北京鼎国，北京)；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(Roche, 瑞士)；RPMI-1640培养基(GIBCO, 美国)；胎牛血清(GIBCO, 美国)；IRF1抗体、GAPDH抗体(天津赛尔生物科技有限公司)；SYBR Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa, 日本)；Real-time PCR引物(miR-23a forward: 5′TGCGGATCACATTGCCAGGGATTTC3′及miR-23a-3p-Reverse:5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT3′；阴性对照U6 forward:5′TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC 3′及U6-Reverse: 5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 3′)购自昆明品品生物科技有限公司。

1.1.2 细胞株 胃腺癌细胞系MGC803购自天津赛尔生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃，5% CO2培养箱内培养。

1.2 方法

1.2.1 乌头碱适宜作用浓度的筛选(MMT法) 将生长状态良好的MGC803细胞接种于96孔板(细胞数约8×103个)，细胞完全贴壁后分别更换为浓度梯度稀释的乌头碱溶液100 μL，继续培养0、24、48、72 h，另设溶剂对照组；分别在0、24、48、72 h后，每孔加10 μL 浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h；后终止培养并弃掉原培养液，每孔加入100 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min；在酶联免疫检测仪上波长为490 nm处测出各孔的吸光度值进行细胞活力检测。根据以下公式计算乌头碱对MGC803细胞的存活率：(实验组OD-空白对照OD)/(对照组OD-空白对照OD)]×100%。

1.2.2 集落形成实验检测肿瘤细胞增殖能力 收集对数期MGC803细胞，接种于12孔板中，设置对照组和实验组(乌头碱处理)，每孔细胞数约150个细胞，每组3个平行，培养24 h后，对照组每孔加入1 mL正常培养基，实验组加入1 mL浓度为60 μg/mL的乌头碱稀释溶液，每3天换液1次，培养14 d；后结晶紫染色，显微镜下计数每孔大于50个以上的集落数目，计算集落形成率。

1.2.3 TUNEL检测细胞凋亡水平 选取生长状态良好且处于对数期的MGC803细胞，消化计数后接种于24孔板内，培养24 h，实验组加入浓度为60 μg/mL的乌头碱溶液1 mL，对照组不加药，继续培养48 h。后弃去原培养液，用PBS清洗两遍，待细胞自然晾干后进行样本固定；样本在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后加入蛋白酶K灭活DNA、RNA，最后加入TUNEL液，恒温箱中避光孵育60 min。把处理好的样本PBS漂洗3次，每次5 min；用无菌双蒸水将1 μg/mL DAPI染液储存液稀释1000倍，每孔加40 μL，室温避光染色5 min。用无菌双蒸水于室温洗2次，5 min/次。荧光显微镜下观察，绿色荧光代表细胞凋亡，蓝色荧光代表生存细胞。

1.2.4 Real-time RCR检测miR-23a的表达水平 收集细胞样本加入1 mL Trizol裂解，提取细胞中的总RNA，经紫外分光光度计测量RNA浓度后，将合格的RNA进行反转录，以得到对应的cDNA，miR-23a-RT:5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACGGAAAT3′。荧光实时定量PCR反应体系：总体积为20 μL，包括cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、SYBRGREEN 10 μL，其余用ddH2O补齐。反应条件为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。正向引物序列：5′TGCGGATCACATTGCCAGGGATTTC3′，反向引物序列：5′ CCAGTGCAGGGTCCGAGGT3′。对照组U6正向引物序列：5′TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC 3′，反向引物序列：5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 3′。封闭miR-23a序列，ASO-23a序列为：5′GGAAATCCCTGGCAATGTGAT3′；ASO-NC序列为：5′CAGTACTTTTGTGTAGTACAA3′。

1.2.5 Western blot检测IRF1蛋白的表达量 按照实验组与对照组分别收集细胞，后加入RIPA裂解液对蛋白质进行抽提。配置10%的SDS-PAGE凝胶，将处理好的蛋白样品取适量上样，恒压80 V电泳2.5 h，对目的蛋白进行分离。后转膜并用5%的脱脂奶粉溶液进行封闭，然后一抗4 ℃结合过夜，1×TBST侵洗3次后加入二抗，室温作用1.5 h。最后用Western LightningTMEnhanced Chemiluminescence Substrate检测显影，将曝光后进行定影处理的胶片用LabWorksTM凝胶成像及分析系统进行摄像，分析内源性IRF1条带的亮度值。

2 结果

2.1 乌头碱抑制胃腺癌细胞MGC803的增殖 已知乌头碱(图1A)具有一定的细胞毒性[15]，为检测其对胃腺癌细胞MGC803增殖的影响，首先将制备的乌头碱母液(20 mg/mL)按一定的浓度梯度进行稀释(0、5、10、20、40、60、80、100 μg/mL)，利用MMT实验对不同浓度的乌头碱溶液对细胞活性的影响进行检测，并计算存活率(图1A)。如图1B所示，乌头碱对MGC803细胞体外增殖有着明显的抑制作用，并且随着作用浓度和作用时间的延长，其抑制作用增强，具有浓度和时间的依赖性。乌头碱作用MGC803细胞48 h后应用GraphPad Prism 5.0计算出的IC50值为(37.76±1.65)μg/mL，后续实验中选择40 μg/mL作为实验组作用的药物浓度。为进一步证实乌头碱抑制癌细胞增殖的作用，集落形成实验显示，与对照组比较实验组细胞集落形成能力下降(图1B)，且具有显著统计学差异。

2.2 乌头碱可诱导细胞凋亡抑制胃腺癌细胞增殖细胞 凋亡是细胞程序性死亡多种形式中研究最为深入的一种。细胞凋亡作为一种重要的细胞死亡形式，当其发生失调时，可打破细胞生长与死亡之间的平衡，是肿瘤发生的重要机制之一[16]。为了明确乌头碱在结果2.1中所表现出的抑癌作用是否与参与细胞凋亡有关，利用TUNEL实验进行检测。如图2A所示，乌头碱处理组与对照组相比，荧光显微镜下观察细胞凋亡数量增加，凋亡指数显示两组存在显著统计学差异(图2B)。

2.3 乌头碱下调内源性miR-23a的表达间接上调其下游靶基因IRF1的水平 大量研究证实miR-23a在包括胃癌在内的多种肿瘤的发生发展过程中扮演癌基因的角色。在胃腺癌细胞MGC803中，miR-23a可通过下调IRF1抑制细胞凋亡[13]。为了研究乌头碱诱导MGC803发生细胞凋亡与miR-23a及其下游靶基因的关系，设置实验组与对照组，通过Real-time PCR检测乌头碱对内源性miR-23a表达的影响，以及利用Western blot检测乌头碱间接对miR-23a下游靶基因IRF1表达的影响。结果如图3显示，经乌头碱处理后，内源性miR-23表达下调(图3A)，同时IRF1表达上调(图3B，3C)。这说明乌头碱通可过参与调节miR-23a抑制细胞凋亡。

2.4 封闭内源性miR-23a后经乌头碱处理细胞凋亡加强 为了进一步明确乌头碱诱导胃腺癌细胞凋亡与调节miR-23a的关系，通过反义miR-23a寡聚核苷酸封闭内源性miR-23a，同时设置对照组进行实验。首先，对反义miR-23a寡聚核苷酸的有效性进行检测，同事发现转染ASO-23a后再经乌头碱处理，miR-23a的表达水平与对照组相比进一步降低(图4A)。将对照组(ASO-NC)及实验组(ASO-23a)分别转染细胞，5% CO2 孵箱37℃培养6h后对照组及实验组加入乌头碱稀释液，继续培养至48h利用TUNEL对细胞凋亡水平进行检测。结果如图4B、4C所示，首先不加药时，转染ASO-23a与转染ASO-NC相比细胞凋亡水平升高，反向验证miR-23a可抑制细胞凋亡；而封闭内源性miR-23a后，加药组与非加药组相比，细胞凋亡明显加强说明加药后内源性miR-23a表达的进一步下降促进细胞凋亡的进一步发生，同时也提示乌头碱诱导细胞凋亡可能与调节miR-23a以外的其他活动相关。

3 讨论

乌头类中药具有很高的药用价值，其活性成分中的一大类为乌头类生物碱，乌头碱即为其中一种。以近些年备受关注的miRNA作为切入点，研究中药活性成分的作用机制具有重要意义。笔者从miRNA水平揭示了乌头碱抑制胃腺癌细胞增殖的新机制，即乌头碱可通过下调癌基因miR-23a的水平，间接上调其下游靶基因IRF1的表达，从而诱导胃腺癌细胞MGC803发生凋亡发挥抗肿瘤作用。

已知报道miR-23a及其下游多个靶基因均可参与肿瘤的发生发展[11,17-18]，那么乌头碱抗胃癌作用的发挥除本文研究的IRF1以外是否与调节其他下游蛋白相关，从而实现一种网络化调控，这一点仍需进一步研究。值得注意的是，IRF1还可激活caspase1、caspase3、caspase7、以及caspase8[19-20]，而其他程序性细胞死亡形式也存在caspase依赖途径，同时随着近些年研究的深入，多种程序性细胞死亡形式之间的联系被逐渐揭示，比如细胞凋亡、细胞自噬、细胞铁死亡等均可参与肿瘤的发生发展，同时发生机制也有交叉[21]。有报道指出乌头碱也可诱导小鼠肝细胞发生细胞自噬[22]，提示对中药活性成分作用机制的研究可以从不同细胞死亡形式入手。另外，乌头碱还具有抗感染及抗炎作用，幽门螺旋杆菌的感染与胃癌的发生关系密切[23-24]，因此乌头碱抑制胃癌的作用是否与抗感染及抗炎作用相关也值得进一步思考。