固封精油熏蒸对油桃采后保鲜效果的影响

邓源喜 许 晖 王家良 陈 佳

(蚌埠学院食品与生物工程学院，安徽 蚌埠 233030)

油桃富含糖分、维生素、纤维、胡萝卜素和多酚等营养元素[1]，且色鲜味美、光洁无毛，深受人们喜爱，但其皮薄肉软，组织含水量高，在采后运输和贮藏过程中易受到机械损伤而导致微生物侵染发生腐烂[2]。我国是油桃的主要生产国，年产量已超过1 200 万t。由于采后病害和衰老过程，油桃品质会随着果实采后运输和贮藏过程而降低[3]。长期以来，油桃采后病害主要通过使用化学防腐剂来进行控制，如咪鲜胺、多菌灵、噻菌灵和苯菌灵等[4]。然而，连续大量使用化学药剂会导致侵染果实的病原菌抗性增强，同时对环境安全和人类健康具有潜在威胁。随着消费者对高品质水果的需求不断增加，开发新型、安全、高效的油桃生物保鲜剂产品显得尤为重要。

植物精油是植物体内的次生代谢物，具有抑菌和保持果蔬品质等作用，已成为果蔬保鲜应用中的热点[5]。精油的化学组成复杂，其醛类、酚类和酮类化合物对病原菌的生长具有明显的抑制作用，而且不易引起病原菌的抗性，符合果蔬采后保鲜绿色包装的新趋势[6-7]。百里香精油主要由百里香酚和香芹酚组成[8]，这类物质对多种采后病原菌都表现出较高的抑制性，如指状青霉菌[9]和胶孢炭疽菌[10]。薄荷精油也含有这2 种抗菌活性成分，而且具有较强的抗氧化活性[11]。此外，采用精油熏蒸处理果蔬，不仅能有效控制曲霉、青霉、毛霉和木霉菌等病原菌，而且能避免直接接触果蔬，减轻对植物的药害以及对感官品质的影响[12]。

国内采用精油熏蒸处理果蔬时，多将精油滴于滤纸片上，然后与果实一起封入储藏盒内[13]。但该方法不能保持盒内空气中精油组分含量，精油浓度较低时无明显的保鲜效果，精油浓度较高时则易产生药害[14]。本研究选用具有广谱抗菌性能的百里香精油和薄荷精油[15]，采用琼脂平板固封不同浓度的百里香精油和薄荷精油熏蒸处理油桃，分析冷藏过程中盒内空气成分，考察冷藏和模拟货架期内油桃的品质参数，同时对褐腐病菌和灰葡萄球菌的抑菌活性进行评价，以期为固封植物精油在果蔬保鲜中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料及处理

供试油桃品种为瑞光7 号，采自北京某农业果园，选择成熟度一致，平均单果重量为145 g 的八成熟果实，采后24 h 运回实验室备用。挑选无病虫害、无机械损伤、大小均一的果实用于试验。褐腐病菌(Monilinia fructicola)和灰葡萄球菌(Botrytis cinerea)在早期试验中从腐败的油桃果实中分离纯化获得，使用前于新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化7 d。

百里香精油、薄荷精油，纯品，湖南长沙格绿生物科技有限公司。无水乙醇、甲醇、石油醚、乙腈、正己烷，均为HPLC 级，德国Merck 公司。偏磷酸、无水硫酸钠、抗坏血酸、氢氧化钾，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

Agilent 7890B-5977B 气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、 Agilent 1260Ⅱ高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；GY-4 型硬度计，浙江艾德堡仪器有限公司；405220 手持折光仪，成都泰华光学有限公司；AR2130 型电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；IKA T25 型组织匀浆机、IKA Vortex GENIUS 3 型涡旋振荡器，德国IKA 公司；DKZ-2B 型电热恒温水浴震荡器，上海一恒科学仪器有限公司；KQ-250DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；N-EVAP 型12 管氮吹仪，上海安普实验科技股份有限公司；3K15 台式高速离心机，德国SIGMA 公司；100 μm PDMS 固相萃取头，美国Supelco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 将10.0 mL 纯精油与88.0 mL 无菌水混合后，加入2 mL 吐温20，摇匀，加入1.5 g 琼脂，搅拌均匀后得到10%精油浓度。同理获得1%精油浓度。将5.0 mL 培养基倒入培养皿中，琼脂固化后，制成精油香膏，现配现用。每70 个油桃为一组，放入透明储藏盒(84 cm×54 cm×30 cm)内，每个储藏盒内放5 个精油香膏。油桃在温度0℃和相对湿度98%条件下贮藏28 d，期间分别用1%百里香精油、10%百里香精油、1%薄荷精油和10%薄荷精油香膏熏蒸，以不加精油香膏作为对照，熏蒸结束后，模拟货架销售，在25℃条件下贮藏5 d。

1.3.2 贮藏过程中储藏盒内精油成分分析 用正己烷将百里香精油和薄荷精油稀释至10 μL·L-1，以50∶1 的分流比直接进样，取7.5 ～40 min 的流出组分，通过相对峰面积计算各样品中各组分的相对百分含量，确定2 种精油的主要挥发性成分，每次分析3 个平行样品。贮藏条件下，采用100 μm PDMS 固相微萃取装置在储藏盒内萃取15 min，用GC-MS 不分流进样分析，研究贮藏过程中精油挥发性成分的变化，分别在第1、第14 和第28 天进行固相微萃取-气相色谱质谱联用(solid phase microextraction coupled with gas chromatography and mass spectrometry，SPME-GCMS)分析，每次分析3 个平行样品。

仪器条件:色谱柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，色谱柱初温50℃、保持3 min，5℃·min-1升温至70℃、保持5 min，1℃·min-1升温至90℃，5℃·min-1升温至150℃，25℃·min-1升温至250℃、保持2 min，恒定氦气流量1.0 mL·min-1，进样口温度250℃，离子源温度230℃，传输线200℃，Scan 模式，电子能量70 eV。

1.3.3 抑菌能力 褐腐病菌和灰葡萄球菌在使用前于4℃用琼脂斜面保存。灰葡萄球菌在马铃薯琼脂培养基中培养15 d，获得孢子悬浮液。褐腐病菌在番茄琼脂培养基(250 mL 番茄汁、750 mL 无菌水、20 g 琼脂)培养5 d 后，向平皿中加入5 mL 无菌水，用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子，再用双层纱布过滤，获得褐腐病菌分生孢子悬浮液。用平板计数法算出孢子悬浮液浓度后稀释至约104CFU·mL-1。取100 μL 孢子悬浮液均匀涂抹在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，与4 种精油香膏一同放入紫外灭菌后的储藏盒内进行熏蒸处理，同时做对照试验。在20 和36 h 时分别计数灰葡萄球菌和褐腐病菌的孢子萌芽情况，当芽管超过分生孢子长度时，认为孢子萌发。每次设置3 个平行试验，考察固封不同浓度百里香精油和薄荷精油熏蒸对灰葡萄球菌和褐腐病菌的抑菌能力，用孢子萌芽率反映其抑菌能力:

1.3.4 腐烂指数 参考潘磊庆等[16]的方法，于33 d贮藏结束后统计不同处理下油桃的腐烂指数:

式中，腐烂等级按腐烂面积占果实表面积的百分比划分: 0 级，无腐烂；1 级，(0，25%]； 2 级，(25%，50%]；3 级，(50%，75%]；4 级(75%，100%]。

1.3.5 失重率和硬度 在试验开始前对每个处理的30 个油桃进行称重，记录初始重量，然后于贮藏7、14、21、28 和33 d 分别称重，按照公式计算失重率:

参考《NY/T 2009-2011 水果硬度的测定》[17]在贮藏0、7、14、21、28、33 d 分别测定油桃硬度。

1.3.6 β-胡萝卜素、抗坏血酸、可溶性固形物和可滴定酸的测定 参考GB 5009.83-2016[18]测定油桃中β-胡萝卜素的含量。样品中的β-胡萝卜素经皂化后，用石油醚萃取、二氯甲烷定容后，用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法定量测定。

参考GB 5009.86-2016[19]测定油桃中抗坏血酸的含量。样品匀浆后，用偏磷酸溶解、超声提取，离子对试剂作为流动相，用HPLC 法定量测定。

参考NY/T 2637-2014[20]，用折射仪测定油桃可溶性固形物含量。

参考张倩等[21]的方法，采用氢氧化钠滴定法测定可滴定酸含量。分别在贮藏0、14、28、33 d 时测定上述4 个指标。

1.3.7 数据处理 采用Microsoft Word 2016 完成图表绘制，Microsoft Excel 2016 完成数据处理和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 贮藏过程中精油挥发性成分的变化

采用直接进样法测定精油的挥发性组分，结果如表1 所示，百里香精油的主要挥发性成分是百里香酚，占26.02%，其次是对伞花烃、α-松油醇和芳樟醇如表1 所示。用百里香精油香膏熏蒸后，于熏蒸1、14 和28 d 时对储藏盒内的空气组分进行SPME-GCMS 分析。结果表明，在28 d 贮藏过程中，对伞花烃是最主要的挥发性成分，与精油直接进样相比，芳樟醇的相对含量也有显著提升(P＜0.05)。相反，作为主要抑菌成分的百里香酚[22]其相对含量却显著降低(P＜0.05)，用10%百里香精油熏蒸1、14 和28 d 时，其相对含量分别为0.60%、2.78%和2.67%，用1%百里香精油熏蒸时，其相对含量分别为0.40%、3.66%和3.67%。这可能是因为直接进样时采用正己烷直接稀释精油，可完全溶解精油的所有组分，而PDMS 固相萃取对精油成分的吸附是一个动态平衡的过程。贮藏过程中，2 种浓度处理下的百里香酚含量均随贮藏时间延长有所增加，最后趋于平衡，说明固封精油熏蒸具有稳定性。

薄荷香精油的直接进样分析结果见表2，其主要成分是芳樟醇，占22.16%，其次是香芹酚(13.29%)、百里香酚(10.67%)和对伞花烃(10.63%)。在贮藏过程中，芳樟醇和桉油精是储藏盒内主要的挥发性成分，二者的相对含量之和在各贮藏阶段均占40%以上。与百里香精油类似，作为主要抑菌功能成分的百里香酚和香芹酚的相对含量与直接进样相比显著降低(P＜0.05)，但其相对含量在贮藏过程中缓慢增加。

表1 百里香精油熏蒸贮藏过程中盒内挥发性成分分析Table 1 Thyme essential oil composition and volatilized compounds analysis in box during fumigation /%

图1 不同熏蒸处理对褐腐病菌和灰葡萄球菌的抑制作用Fig.1 M.fructicola and B.cinerea conidial germination percentage with different essential oils fumigation in vitro

表2 薄荷精油熏蒸贮藏过程中盒内挥发性成分分析Table 2 Savory essential oil composition and volatilized compounds analysis in box during fumigation /%

2.2 不同熏蒸处理对2 种病原菌的抑制作用

在4 种熏蒸处理下培养褐腐病菌和灰葡萄球菌，其孢子萌发结果见图1。结果表明，精油挥发性成分有明显的抑菌活性，其抑菌效果取决于精油的种类、浓度和病菌种类。与对照组相比，10%薄荷精油熏蒸几乎能完全抑制褐腐病菌的萌芽，1%和10%浓度的百里香精油能将褐腐病菌的萌芽率分别降低35.4 和49.1个百分点。此外，当精油浓度增加时，抑菌能力均明显提高。

2.3 精油熏蒸处理对油桃腐烂指数的影响

由图2 可知，精油熏蒸处理能够明显减少油桃的腐烂。在0℃冷藏期间，5 种处理下的油桃均未发生腐烂，而在25℃贮藏5 d 后，对照组腐烂指数为23.3%，从腐烂果实中分离出的病原菌经生物鉴定，确认由褐腐病菌和灰葡萄球菌引起的腐烂指数分别为10.7%和8.0%，此外，还有4.9%的腐烂由链格孢菌引起。精油熏蒸处理后腐烂指数均有不同程度的降低，其中10%薄荷精油熏蒸效果最好，腐烂指数只有4%，这与体外抑菌试验结果相符。对照组中，褐腐病菌引起的腐烂占腐烂油桃的45.9%，说明褐腐病菌是油桃自然贮藏的主要致病菌，经过1%和10%百里香精油熏蒸后，褐腐病引起的腐烂指数降低到3.3%和2.5%，相对发病率为45.2%和26.9%，但是灰霉病引起的腐烂指数仍有4%和6.8%，相对发病率从34.3%升至54.7%和73.1%，说明灰葡萄球菌对2 种精油均不敏感。

2.4 精油熏蒸处理对油桃失重率和硬度的影响

采后果实的呼吸作用和蒸腾作用会导致其失水失重，影响果实硬度。由图3-A 可知，在整个贮藏期间，对照组和精油熏蒸处理组油桃的失重率均呈持续上升趋势，在28 d 冷藏结束后，对照组与1%百里香精油和1%薄荷精油组差异显著(P＜0.05)，与10%百里香精油组差异极显著(P＜0.01)。25℃模拟货架期(28 ～33 d)时，果实失重率明显上升，且对照组显著高于精油熏蒸处理组(P＜0.05)。由图3-B 可知，在整个贮藏期间，果实硬度呈持续下降趋势，对照组与精油熏蒸处理组之间无显著差异(P＞0.05)。但在25℃模拟货架期(28～33 d)时，果实硬度明显降低，对照组硬度最低。说明精油熏蒸能有效防止油桃水分散失，降低果实失重率，但对果实硬度的影响不显著，这可能是油桃品种本身品质的原因。

图3 精油熏蒸处理对油桃果实失重率(A)和硬度(B)的影响Fig.3 Effects of essential oil treatment on weight loss rate (A) and firmness (B) of nectarine fruits

2.5 精油熏蒸处理对油桃β-胡萝卜素、抗坏血酸含量、可溶性固形物和可滴定酸的影响

通常情况下，类胡萝卜素因受光照和空气的影响而逐渐减少。由图4-A 可知，在冷藏期内，油桃果实β-胡萝卜素含量整体呈下降趋势，精油熏蒸处理组与对照组无显著差异(P＞0.05)，25℃贮藏阶段，果实β-胡萝卜素含量下降速度明显增加，且对照组的下降速度比精油熏蒸处理组明显增加，精油熏蒸处理组果实β-胡萝卜素含量整体保持稳定，且各处理间无显著差异(P＞0.05)。试验结束时，1%和10%百里香精油熏蒸油桃的β-胡萝卜素平均含量最高，分别为105 μg·100g-1和102 μg·100g-1。抗坏血酸同样整体呈持续下降趋势(图3-B)，虽然精油熏蒸处理能够降低抗坏血酸的损失，但在33 d 贮藏期结束时，精油熏蒸处理组与对照组间无显著差异(P＞0.05)，且果实抗坏血酸比β-胡萝卜素损失更大。

图4 精油熏蒸处理对油桃果实β-胡萝卜素(A)和抗坏血酸(B)含量的影响Fig.4 Effects of essential oil treatment on β-carotenoids (A) and ascorbic acid (B) of nectarine fruits

可溶性固形物和可滴定酸可以反映油桃营养物质的消耗速度和程度，是衡量保鲜效果的重要指标。由图5 可知，在整个贮藏期间，精油熏蒸处理组果实的可溶性固形物和可滴定酸含量均与对照组差异不显著(P＞0.05)，表明精油熏蒸对二者的影响较小。对照组和精油熏蒸处理组的可溶性固形物和可滴定酸含量整体保持一致。可溶性固形物含量在贮藏28 d 时略微上升，后期25℃贮藏阶段降低。这可能是因为在贮藏初期淀粉、果胶、粗纤维等水解产物增加，表现为可溶性固形物含量升高，模拟货架时温度升高，呼吸作用加强，可溶性固形物被消耗[6，23]。可滴定酸含量在整个贮藏期间均呈缓慢下降的趋势。

3 讨论

百里香酚和香芹酚是精油的主要抗菌活性成分，SPME-GCMS 分析结果表明，精油熏蒸贮藏过程中储藏盒内二者的相对含量均缓慢增加，最后趋于平衡，说明采用琼脂平板固封精油能让精油缓慢释放，并持续维持盒内空气抑菌组分的相对含量。此外，即使空气中百里香酚和香芹酚的浓度很低，也能有效抑制褐腐病菌的萌芽生长，这与王京法等[24]的体外抗菌结果一致。本研究结果还表明，当精油浓度增加时，其抑菌活性明显提高，这与Svircev 等[25]的研究结果相符。值得注意的是，百里香精油和薄荷精油可以有效抑制褐腐病菌的生长，10%薄荷精油甚至基本能完全抑制褐腐病菌的萌芽，但在本研究中灰葡萄球菌对2 种精油的敏感性均较低，导致精油、熏蒸处理中灰霉病成为油桃腐烂的主要病菌[26]。Arrebola 等[27]也曾发现这2种精油对油桃灰葡萄球菌的抑菌活性不强，但施俊凤等[28]和王建清[29]研究百里香精油对番茄和冬瓜中灰葡萄球菌的抑菌活性发现，灰葡萄球菌对百里香精油很敏感，这种差异可能是由试验对象和精油浓度不同引起的。

使用固封精油熏蒸油桃后，能够很好地保持果实的硬度，降低果实失重率，这是因为精油蒸汽在油桃表面形成的涂层可以改变气体渗透，降低呼吸作用和水分损失[30]。有研究表明，用精油熏蒸樱桃[31]、葡萄[32]和桃子[33]时，也能降低果实的失重率。

图5 精油熏蒸处理对油桃果实可溶性固形物(A)和可滴定酸(B)含量的影响Fig.5 Effects of essential oil treatment on soluble solid content (A) and titratable acid (B) of nectarine fruits

固封精油熏蒸能减少β-胡萝卜素和抗坏血酸的损失，这是因为植物精油具有抗氧化活性和自由基清除能力[34]。Valero 等[35]发现百里香精油结合气调保鲜能减少葡萄抗坏血酸的损失。张有林等[36]也发现百里香精油的抗氧化和自由基清除能力随浓度的增加而增强。这些研究均表明精油熏蒸能减少果实营养物质的损失。但抗坏血酸和脱氢抗坏血酸是植物体内重要的抗氧化活性成分[37]，它们的化学性质和代谢功能决定了这类物质在贮藏过程中比β-胡萝卜素更容易损失[38]，这与本研究结果一致。

4 结论

本研究结果表明，用琼脂平板固封百里香精油和薄荷精油，可使精油在储藏盒内缓慢释放，并在较长时间内维持储藏盒内精油功能成分的浓度，有效抑制褐腐病菌的生长，减少油桃的腐烂，延缓后熟衰老，较好地保持果实的失重率和硬度。但灰葡萄球菌对这2 种精油挥发性成分的敏感性较低，在褐腐病菌被抑制的情况下，导致精油熏蒸处理中灰葡萄球菌成为主要致病菌，引起灰霉病。另外，精油熏蒸能够减少抗坏血酸和类胡萝卜素的氧化，但对果实的可溶性固形物和可滴定酸含量无明显影响。综上，精油香膏熏蒸可以作为油桃采后保鲜的有效手段，具有较大的商品化应用潜力。