肺外结核病微生物学诊断方法的研究和应用进展

玄琦月,韩雪,付英梅,2*

1.哈尔滨医科大学微生物学教研室, 黑龙江省感染与免疫重点实验室, 哈尔滨 150081;2.哈尔滨医科大学伍连德研究所, 哈尔滨 150081

肺外结核病(extrapulmonary tuberculosis, EPTB)是指由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染所引起的发生在肺部以外器官和部位的结核病，可累及人体的任何部位，胸膜、淋巴结和骨是EPTB最常见的病变部位，其次可见于肠道、腹膜、肾、生殖系统、脑膜等。EPTB目前没有统一的分类标准，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)对EPTB诊断的一般标准为：标本MTB培养阳性；或组织学检测MTB阳性；或与活动性EPTB一致的典型临床证据[1]。

根据WHO 2020年公布的全球结核病报告，2019年，全球新发结核病约7 100万例，其中16%为EPTB，东亚和南亚地区EPTB的比率较高，为19%[2]。我国是全球22个结核病高负担国家之一，EPTB的发病率也较高。天津市2015—2017年登记报告的新发EPTB共1 190例，占全部结核的10.4%，三年间，EPTB的总发病率从2.05/10万上升到3.24/10万[3]；最新公布的一项研究显示，近十年间，北京胸科医院的住院结核患者中，EPTB占33.4%[4]。

早期诊断的EPTB患者，经正规抗结核治疗多可治愈，但未得到早期有效治疗的EPTB患者，可导致多种严重后果，例如，中枢神经系统结核有较高的死亡率，患者可在发病后的8～11周死亡[5-6]；骨关节结核可并发畸形、截瘫、甚至死亡[7]；泌尿系统结核可并发膀胱挛缩、肾功衰竭等[8]。以前认为EPTB的传染性不强，但新近研究发现，EPTB也具有一定传染性[9]。因此，及早对EPTB做出有效诊断，有助于提高疾病治愈率、降低死亡率。目前，EPTB诊断的主要依据为临床表现和病原学检查，而多数EPTB患者的症状不典型，临床和影像学表现可与多种其他疾病相似，因此，微生物学检测方法对EPTB的诊断至关重要。近年来，EPTB的病原学检测方法得到了快速的发展，除了传统的细菌学检查方法，标本中MTB抗原和核酸的检测对EPTB的早期和快速诊断提供了丰富的参考证据。本文总结了近年来EPTB细菌学检查方法、MTB抗原检测与分子生物学检测等微生物学诊断方法的概况及近年来的应用进展，并对这些检测方法的特点、优劣势和适用范围等进行了分析、比较，以期为今后EPTB病原学诊断的研究提供相关信息。

1 细菌学检查方法

细菌学检查方法虽然总体阳性率不高，但仍是目前诊断结核病的主要方法，主要包括改良的涂片镜检法和MTB培养法。

1.1 涂片镜检法

涂片镜检法是国内外普遍应用的EPTB实验室检查方法，但因EPTB患者的体液样本中细菌数量少，传统的染色涂片法检出率较低，多使用改良抗酸染色法与液体快速培养法以提高MTB检出率。改良抗酸染色法是先将样品置于Cytospin4型细胞离心涂片机中离心浓集菌，然后再使用抗酸染色剂染色[10]。在脑脊液样本的检测中，Cytospin制片染色法不仅提高了细胞外MTB的检出率，还可检出白细胞内的细菌[10]。但Cytospin制片染色法要求脑脊液中有足够的MTB细菌数量，通常要求在5 000～50 000个·mL-1[11]，而临床上很多情况下，脑脊液含菌量平均仅10个·mL-1左右[12]，所以，该法对结核性脑膜炎患者脑脊液中细菌的总检出率仅在10.0%～20.0%[13]。此外，荧光染色技术也被应用于EPTB的检查中，其是将抗酸染色法的复红改为金胺类，借助荧光显微镜观察，可将结核性脑膜炎细菌的检出率提高至79.2%，特异度也显著高于Cytospin制片染色法[14]。

1.2 MTB培养法

MTB培养法包括罗氏培养法和液体快速培养法。目前广泛使用的是液体快速培养法，BACREC MGIT 960液体快速培养法的敏感度和特异度分别达43.7%和93.0%[15]。联合显微镜观察药物敏感度检测技术(microscopic observation drug susceptibility assay, MODS)可同时检测MTB的存在及其药物敏感性，其主要原理是利用MTB在适宜的液体培养基中生长速度快于固体培养基、且可形成特征性索状结构的特性，采用添加抗结核药物的液体培养基对标本进行直接培养，通过显微镜观察特征性索状结构，以判断标本中是否存在MTB[16]。

2 MTB抗原检测

EPTB患者的体液标本中含菌量较低，导致细菌学检查方法敏感度低、特异度差，且培养法耗时较长，无法快速对EPTB患者进行诊断。而抗原检测是检测MTB特异性分泌蛋白或其细胞壁的特异性脂质成分[17-18]，对标本含菌量的要求不高，且早期即可诊断。目前在诊断研究中使用较多的抗原包括MPT64、抗原85B(antigen 85B, Ag85B)、脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan, LAM)、早期分泌性抗原靶-6(early secretory antigenic target-6, ESAT-6)等，研究者对单一抗原和多抗原联合的诊断效能都进行了测试。

2.1 单一抗原检测

2.1.1MPT64检测 MPT64是发现最早的MTB特异性分泌蛋白，仅存在于结核分枝杆菌复合物(mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)中[17]。利用免疫细胞化学染色(immunocytochemistry, ICC)方法检测MPT64抗原是一种简单而直接的方法，可用于EPTB的早期诊断。Davidsen等[19]收集了67例结核性淋巴结炎患者的淋巴活检标本，利用ICC法检测MPT64抗原，发现敏感度和特异度可达69.0%和95.0%。Purohit等[20]的研究结果也同样显示了MPT64抗原检测的高敏感度(96.0%)与高特异度(96.0%)。最近挪威的一项研究发现，MPT64抗原的检测还可用于福尔马林固定的活检标本，敏感度为37%，尽管其敏感度不如培养法(50%)，但其诊断效能优于细针穿刺和脓汁等液体样本的检查，为病理学实验室的病原学诊断提供了快速、特异的诊断参考[17]。

2.1.2Ag85B检测 Ag85B存在于MTB分泌蛋白中，可与人纤维结合蛋白结合，与MTB致病性密切相关[21]。Singh等[22]开发了一种新型的间接夹心免疫聚合酶链式反应(immuno-PCR，I-PCR)检测法，该方法兼具PCR的指数扩增能力和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的灵活性，对105例EPTB患者的胸水、脓汁等液体样本分别以I-PCR方法和传统的ELISA法检测Ag85B，结果发现，总体敏感度分别为68.6%和52.4%，特异度分别为92.0%和96.0%，但I-PCR检测Ag85B可以更快速地获得结果，且I-PCR检测Ag85B的检出限为1 fg·mL-1，能检出比ELISA方法低106倍的抗原量，敏感度更高。

2.1.3LAM检测 LAM是MTB细胞壁的一种脂多糖，尿脂阿拉伯甘露糖测定法(lateral flow urine lipoarabinomannan assay, LF-LAM)是一种新型的即时检验方法，可检测活动性结核病患者尿中的LAM。研究表明，联合使用LF-LAM与痰涂片镜检法检测MTB的合并敏感度为59.0%，比单独使用涂片法提高了19.0%，而特异度为92.0%，仅比单独涂片法降低了6%，说明LF-LAM与痰涂片镜检联合使用有助于结核病的诊断[18]。殷晓云等[23]使用蛋白芯片检测了74例EPTB患者的血清LAM，结果显示敏感度为56.8%，特异度为83.2%，提示LAM检测对较难诊断的EPTB有重要意义。

2.1.4ESAT-6检测 ESAT-6是由MTB短期培养滤液纯化而来，属早期特异性分泌蛋白[21]。Mehta等[24]通过I-PCR方法，单独检测42例EPTB患者胸水标本中的ESAT-6，结果显示敏感度为38.1%，特异度为93.3%。

2.2 多种抗原联合检测

2.2.1Ag85B、ESAT-6与索状因子联合检测 索状因子(6,6-双分枝菌酸海藻糖)是存在于有毒力的MTB细胞壁中的脂质成分[25]。利用I-PCR方法对40例EPTB患者血清中的Ag85B、ESAT-6与索状因子进行联合检测，结果显示敏感度和特异度分别为77.5%和92.0%[25]。在此研究的基础上，同样利用I-PCR方法，对40例EPTB患者的胸膜液标本进行抗原联合检测，结果表明其敏感度和特异度为61.9%和92.0%，均低于单独检测Ag85B[24]。

2.2.2培养滤液蛋白10与ESAT-6联合检测

培养滤液蛋白10(culture filtrate protein-10, CFP-10)也是由MTB短期培养滤液纯化而来的，可刺激机体产生特异性抗体[21]。CFP-10和ESAT-6的表达可以作为MTB感染后的早期检测，对于诊断活动性结核也具有重要意义。基于血清学的方法对21例EPTB患者的血清标本进行抗原联合检测，敏感度为85.7%，同时在健康人与高危人群中也表现出了高特异度(87.1%～100%)[26]。

2.2.3结核特异性抗原与植物凝集素比率的检测 植物凝集素(phytohemagglutiinin, PHA)的值反映了免疫抑制的作用，可用于判断不同免疫状态的EPTB患者结核特异性抗原(tuberculosis-specific antigen，TBAg)检测的可信度[27]。Wang等[28]选择了CFP-10与ESAT-6联合抗原作为TBAg，对734例EPTB血清标本通过结核感染T细胞斑点试验(tuberculous T cell enzyme-linked immuno-spot assay，T-SPOT.TB)的方法分析TBAg/PHA比率，以0.2作为阈值来区分EPTB与非EPTB，结果表明敏感度和特异度为70.8%和91.6%。此外，在抗结核治疗期间，TBAg/PHA比率显著降低，表明该值也可用于监测治疗效果[28]。

此外，还可根据结核感染时机体的免疫学反应，通过γ干扰素释放试验(interferon-gamma release assay, IGRA)及血清中多种抗体的检测，对肺外结核进行辅助诊断[23,27]。

3 结核分枝杆菌的分子生物学检测

分子生物学检测方法将结核病的诊断提高到了分子和基因的水平。通过直接检测标本中MTB的特异性靶基因，能够更敏感、更快速地检出标本中MTB的核酸成分，大幅度提高诊断的敏感度与特异度。

3.1 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR)技术是在PCR指数扩增期间，通过连续监测荧光信号的变化，并与加入的已知定量标准品比较，来分析目的基因的拷贝数，实现对核酸的实时定量[29]。早期所用的FQ-PCR法检测的靶标是MTB基因的保守片段，可动态检测标本中MTB-DNA的含量，不受细菌表型和耐药性影响[30]。FQ-PCR法用于结核病诊断，其敏感度和特异度明显高于涂片法，且操作简便、快速、便于推广、无须特殊精密仪器，对于结核病尤其是EPTB的诊断具有较高的应用价值。李艳红等[31]对22例EPTB患者的体液标本同步检测，结果表明FQ-PCR法的阳性率、敏感度、特异度分别为86.4%、95.0%和100%，高于涂片法的59.0%、60.0%和50.0%。

目前，最常用的FQ-PCR法是Xpert Mtb/RIF [XpertMycobacteriumtuberculosis(MTB)/rifampicin (RIF) assay] 技术，该技术以ropB为靶基因，通过实时荧光PCR扩增，同时检测MTB和利福平(rifampicin，RIF)耐药[32]。2013年，WHO建议将Xpert MTB/RIF 用于诸如结核性淋巴结炎和结核性脑膜炎等EPTB的诊断[33]。选取238例EPTB患者的体液标本进行Xpert Mtb/RIF检测，结果发现总体敏感度为65.5%，特异度为100%，其中脓液标本的敏感度最高，为88.5%，脑脊液标本的敏感度较低，为33.3%[15]。Tadesse等[34]对572例EPTB患者的肺外标本进行检测，结果发现总体敏感度和特异度为75.0%和98.0%，其中敏感度最高的是淋巴结标本，为89.8%，表明Xpert Mtb/RIF检测可用于结核性淋巴结炎患者淋巴结标本的初筛。

虽然Xpert Mtb/RIF检测和结核诊断金标准培养法有很高的阳性一致性，且特异度更高，但Xpert MTB/RIF技术在低细菌负荷下具有较差的敏感性，并且无法区分MTB的活菌和死菌[35-36]。对于骨关节和活检标本等需要研磨和均质化的标本，敏感性也较差[37]。为了克服这一局限，最近开发了新一代检测技术Xpert MTB/ RIF Ultra(GX-Ultra)，这个方法是在Xpert MTB/ RIF的基础上，添加了MTBC的2个新靶标(IS1081和IS6119)，较大提高了在低细菌负荷下的灵敏度[38-39]。通过GX-Ultra检测82例涂阴肺外标本的敏感度可达75.9%[40]。使用208例胸膜结核患者的胸膜液标本对Xpert Ultra和Xpert的性能进行分析，Xpert Ultra的敏感性为44.2%，高于Xpert的19.23%，二者特异性均为98.7%[41]。

3.2 DNA探针技术

探针技术主要包括核酸杂交探针、线性探针测定和核酸扩增测试(nucleic acid amplification testing, NAAT)等[42]，使用寡核苷酸探针鉴定DNA靶标，这些方法不依赖于核酸扩增来为测试提供足够数量的靶分子。已经选择的靶标包括来自16S或23S rRNA基因的基因间隔区(internal transcribed spacer, ITS)、MPB64基因、插入序列986或6110等[43]。Wang等[42]基于插入序列6110开发IS4引物和探针，设计了一种新型实时定量聚合酶链式反应的NAAT，并对130例临床标本进行检测，结果发现，肺部标本的临床敏感度和特异度为92.0%和76.9%，肺外标本的临床敏感度和特异度为92.3%和86.8%。值得注意的是，IS4虽可以区分MTB和非结核分枝杆菌，但不能区分活菌和死菌，因此不适于治疗监测。

3.3 实时荧光核酸恒温扩增检测技术

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneous amplification and testing, SAT)是近年研发的一项技术，以MTB特异的16S rRNA为检测靶标，在同一温度(42 ℃)以RNA为起始模板，通过莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(moloney murine leukemia virus，MMLV-RT)产生1个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶(T7 RNA polymerase，T7RNP)从该拷贝产生100～1 000个RNA拷贝，通过恒温RNA扩增技术扩增产物杂交后释放出荧光信号，对荧光信号进行实时检测，从而快速准确地判断待检样本中是否有MTB存在[44]。对433例EPTB样本进行检测，结果表明，培养法的敏感度和特异度为29.3%和98.0%，而SAT检测的敏感度和特异度为83.6%和79.4%[45]。由于RNA只存在于活菌中，在疾病活动性、药物疗效检测方面有较高的临床价值，且RNA极易降解，可有效避免污染。

3.4 液滴数字PCR技术

液滴数字PCR技术(droplet digital PCR, ddPCR)是最近开发的一种高灵敏PCR方法，可以成功量化结核病患者血液样本中的CFP-10和结核分歧杆菌Rv1768基因DNA微量拷贝数，且比FQ-PCR更敏感，ddPCR对CFP-10检测限为1.2拷贝·μL-1，而FQ-PCR为15.8拷贝·μL-1[46]。通过ddPCR对28名肺结核患者及28名EPTB患者的血液标本进行检测，结果发现肺结核和EPTB标本的敏感度均为100%[47]。ddPCR可在感染3周后检测到低水平的MTB-DNA，适合用于疫苗开发、体内细菌负荷评估和早期结核病的诊断[46]。

4 不同检测方法对于诊断EPTB的效能比较

目前，EPTB的微生物学诊断方法主要包括细菌学检查方法、MTB抗原检测和MTB核酸检测，不同检测方法的优缺点、适用范围存在差异(表1)。细菌学检查方法是国内外普遍应用的实

表1 EPTB常用微生物学检测方法的比较Table 1 Comparison of microbiological detection methods for extapulmonary tuberculosis

验室检查方法，但临床中的标本含菌量较低，难以达到涂片法要求的细菌数量，而培养法耗时较长，不适用于EPTB的快速诊断。抗原检测可使用血清标本、活检标本或福尔马林固定的活检标本，相较于细菌学检查方法对标本的含菌量要求不高，且适用于EPTB的早期诊断，但不同的抗原敏感度和特异性仍存在一定差异。核酸检测能够更敏感、更快速地检出标本中MTB的核酸成分，适用于EPTB的早期快速诊断。

5 展望

随着免疫缺陷和免疫受损人群的增多，MTB的感染率增加，肺外组织和器官的感染也在增加。同肺内结核病相比，EPTB患者缺乏特异性的临床表现， EPTB的早期诊断是临床上的一大难题。由于EPTB不同感染部位的限制，在很大一部分病人中不易获得适于实验室检查的标本，因此，探索不受标本类型限制的早期、快速、敏感、特异的新诊断方法，是今后研发新型标志物的方向。另一方面，目前正在研究和应用的诊断技术，对EPTB的诊断效能很大程度上受标本类型、结核病地区负荷的影响，在今后的研究中，应进一步评估影响这些技术诊断效能的因素。在此基础上，兼顾诊断方法的经济适用性和使用广泛性，以提高EPTB实验室诊断效能，早期、有效地对EPTB进行防控和治疗。