微波辅助复合酶法提取北五味子多糖的工艺研究

薛俊礼，吕 洋，杨艳艳，曹雪玲，吉惠杰

吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022

北五味子(SchisandrachinensisBaill.)是一种多年生落叶藤本植物，属于木兰科，主要生长在我国的东北地区。五味子果实作为珍贵的药用资源，早在《神农本草经》中，就已经有了对其详细的介绍和记载[1]。大量研究表明：木脂素、挥发油和多糖是北五味子最主要的化学成分，其中多糖在保护肝脏[2]、抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、促进免疫[5]等方面有着良好的效果。因此，探究高效的现代化提取方法，优化工艺参数，增加多糖的得率，为五味子多糖的工业化生产提供新技术和路线意义重大。传统上植物多糖的获取主要采用加热回流法[6-7]，该法需要冗长的提取时间、较高的温度、大量的提取溶剂，且目标成分得率低[8]。

微波因具有较强的穿透能力、较高的加热效率、对目标成分理想的选择性萃取能力等显著优势，在诸多植物主要活性成分的提取领域受到了越来越广泛的关注[9-10]。酶法破坏细胞壁能力强，药材中胶质和蛋白易于被水解，细胞内药理活性成分容易释放，亦逐渐应用到天然产物的提取领域[11]。因此，作者拟充分利用微波与酶的优点，将两种提取方法有机结合，并通过响应面试验和正交试验对工艺参数进行系统优化，确定微波辅助酶法提取多糖的最佳工艺条件；此外，作者用纤维素酶、蛋白酶和果胶酶组成的复合酶代替传统的单一酶，并对3种酶的含量组成进行优化，以充分利用酶的特异性和专一性优势，使北五味子多糖得到完全提取，为工业化生产提供重要的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

北五味子果实购买于吉林省通化市，其产地为长白山地区。

无水乙醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸等试剂均为分析纯。果胶酶(酶活20 000 U/g)、纤维素酶(酶活15 000 U/g)：上海蓝季科技发展有限公司；木瓜蛋白酶(酶活50 000 U/g)：北京奥博星生物技术有限责任公司；试验用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

DZF-6050电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FA-2004A电子分析天平：上海精天电子仪器有限公司；YCYN-J1-3微波炉：上海郓曹电子科技有限公司； RT-08多功能粉碎机：荣聪精密科技有限公司；722可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司； SHZ-D循环水式真空泵：河南省巩义市英峪仪器一厂。

1.3 试验方法

1.3.1 北五味子的预处理[12]

将购买的北五味子果实在室温下晾干，然后用粉碎机粉碎，过筛(80目)，得到均匀的北五味子粉。称量50.0 g，加入150 mL沸程为60～90 ℃的石油醚，以水浴加热的方式在90 ℃下回流12 h。除去石油醚萃取液，将药渣加入300 mL 80%的乙醇溶液中，78 ℃下回流4 h，收集药渣，即为预处理的五味子，备用。

1.3.2 复合酶组成的优化及多糖提取工艺流程

取100 mL圆底烧瓶，依次加入1.0 g 预处理的五味子、 50 mL蒸馏水和一定质量分数(0.5%、 1.0%、 1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)的单一酶；然后将烧瓶置于50 ℃的恒温水浴中，安装好冷凝回流装置，进行酶解，持续3 h。所得多糖提取液的混合物离心，收集上清液，烧瓶壁及黏附药渣用适量二次蒸馏水洗涤2次，洗液与上清液合并，并用旋转蒸发仪浓缩至少量体积。搅拌条件下，将无水乙醇加入多糖的浓缩液中至体积分数达到80%，然后置于4 ℃的冰箱中，沉淀12 h。抽滤、用95%乙醇洗涤沉淀，干燥，即得五味子粗多糖。试验中分别采用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶进行提取，探索不同的酶对提取五味子多糖的影响。

1.3.3 微波辅助酶法提取五味子多糖的工艺流程及条件优化

取100 mL平底烧瓶，加入预处理的五味子1.0 g，然后用磨口玻璃塞封口，置于微波炉中，在无溶剂条件下辐射特定时间(2、4、6、8、10、12 min)。微波辐射结束后，取出平底烧瓶，分别加入50 mL特定pH(3、4、5、6、7、8)的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液和经过优化的0.05 g复合酶(纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶的质量比为1∶2∶2)。待水浴温度调至恒温(25、35、45、55、65、75 ℃)时，浸入上述含有复合酶和五味子的圆底烧瓶，并安装好回流装置，持续一段时间(1、2、3、4、5、6 h)，完成复合酶对微波处理后的五味子的酶解及多糖的萃取。多糖萃取液按照1.3.2所述方法处理，获得北五味子多糖。考察微波辐射时间、提取剂pH值、酶解温度、酶解时间对五味子多糖得率的影响。

1.3.4 多糖得率的测定

用葡萄糖作为标准物，通过苯酚-硫酸法[5-6]进行分析。以准确配制的葡萄糖质量浓度作为横坐标， 490 nm处检测的吸光度作为纵坐标，建立葡萄糖标准曲线。

按照下列公式计算多糖得率：

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

标准曲线及回归方程见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

在标准曲线的质量浓度区间(10～70 μg/mL)内，测定的吸光度与标准物的质量浓度呈良好的线性关系。

2.2 复合酶组成的优化试验结果

2.2.1 单因素试验结果

分别采用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶提取五味子多糖，不同酶添加量对多糖得率影响结果见图2。

图2 酶添加量对五味子多糖得率的影响Fig.2 Effect of enzyme amount on the yield of polysaccharides

由图2可知，随着3种酶用量的增加，五味子多糖得率均呈现先增加后缓慢下降的趋势。这可能是因为酶用量太高时，溶液体系中的酶分子达到饱和状态，从而抑制了五味子多糖的溶出[13]。纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶的最佳添加量分别为1.5%、2.0%、2.0%。因此，将由1.0%～2.0%的纤维素酶、1.5%～2.5%的木瓜蛋白酶和1.5%～2.5%的果胶酶组成的复合酶进行正交试验优化。

2.2.2 正交试验结果

在探究单一酶用量对多糖得率影响的基础上，基于L9(34)正交表，设计正交试验对复合酶的组成进行优化，试验设计和安排见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

复合酶提取五味子多糖的正交试验结果见表2。

表2 复合酶提取多糖的正交试验结果Table 2 Orthogonal design for polysaccharide extraction by complex enzymatic method

由表2可知，不同酶对五味子多糖得率影响的主次顺序为A>C>B，即纤维素酶>木瓜蛋白酶>果胶酶；最佳组合为A1B2C2，因此，确定复合酶纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶的质量比为1∶2∶2，且复合酶总质量分数为5%。

2.3 微波辅助复合酶提取五味子多糖的单因素试验结果

微波辐射时间、提取剂pH值、酶解温度和酶解时间对五味子多糖得率影响的试验结果见图3—图6。

图3 微波辐射时间对五味子多糖得率的影响Fig.3 Effect of microwave irradiation time on the yield of Schisandra chinensis Baill. polysaccharide

图4 pH值对五味子多糖得率的影响Fig.4 Effect of pH on the yield of Schisandra chinensis Baill. polysaccharide

图5 酶解温度对五味子多糖得率的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of Schisandra chinensis Baill. polysaccharide

图6 酶解时间对五味子多糖得率的影响Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of Schisandra chinensis Baill. polysaccharide

由图3可知，在辐射的前8 min内，随着微波辐射时间的持续延长，五味子多糖得率逐渐增加。后续进一步延长辐射时间，多糖得率不再发生明显的改变。因此，选择6～10 min进一步优化。

由图4可知，当提取剂的pH值从3变化到5时，五味子多糖的得率逐渐增加；pH值从5变化到8时，多糖得率显著下降。原因可能是pH值对复合酶的活性影响比较大，过高过低都影响复合酶水解细胞壁的能力，因此，选择pH 4～6为后续试验的优化区间。

由图5可知，在起始一段时间内，随着酶解温度的升高，五味子多糖得率显著增加；超过55 ℃后，多糖得率反而明显下降。原因可能是过高的温度破坏了复合酶的活性，因此，选择45～65 ℃进一步优化。

由图6可知，当酶解时间从1 h延长到2 h时，五味子多糖得率急剧增加；进一步延长酶解时间，从2 h延长到5 h时，多糖得率几乎不变。因此，选择1～3 h进一步优化。

2.4 微波辅助复合酶提取多糖的响应面结果分析

2.4.1 模型的建立及显著性检验

为了对试验工艺进行系统的探究和准确的评价，基于Box-Behnken 中心组合原理[6]，设计响应面优化试验，试验因素与水平见表3。

表3 微波辅助酶法提取多糖的响应面优化试验因素与水平Table 3 Factors and levels of RSM for polysaccharide extraction with microwave-assisted enzymatic method

采用Design-Expert 8.0软件，对试验工艺条件进行优化并分析，结果见表4。

表4 响应面试验设计及结果Table 4 Response surface Box-Behnken design and results

采用二次多项式逐步回归拟合法，对表4中29组多糖得率的数据进行分析，所得的方程如下：Y=14.32-0.57A-0.06B+0.06C+0.19D+0.05AB+0.06AC-0.12AD-0.22BC-0.14BD-0.12CD-0.43A2-0.09B2-0.18C2-0.04D2。

通过对方差和相关系数进行分析，可以对试验的优化模型进行准确的评价，统计结果见表5。

表5 回归模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

由表5可知，该模型的F=14.44，P<0.000 1，表明试验所选用的二次多项模型极其显著。在所有影响因素中，A、D、A2、C2的P值小于0.05，而酶解时间和微波辐射时间对多糖的提取有极显著的影响；方程的交互项BC的P<0.05，表明酶解温度和溶液pH值的交互作用对五味子多糖的提取影响很显著，其余因素间的交互作用影响不显著。本试验失拟项的F=1.29，P>0.05，说明由于误差造成的方程拟合缺陷无显著性影响，数据中没有异常点，模型适当，不需要引入更高次数的项；回归方程的R2=93.52%，表明本试验中93.52%的数据可以用该模型来解释，微波辅助复合酶法提取北五味子多糖用此模型分析，可取得较为理想试验结果。

2.4.2 提取工艺的响应曲面分析

为了更直观地表示各因素及其交互作用对多糖得率的影响，可将酶解时间、pH值、提取温度和微波辐射时间4个因素中的两个固定在零水平，考察其余两个因素对多糖得率的影响，结果见图7。

由图7a—7c可知，当酶解温度、微波辐射时间和pH值3个因素取值相同时，在A因素方向，曲线变化明显较陡，多糖得率随着酶解时间的变化显著改变，表明酶解时间对五味子多糖的得率影响极为显著；由图7c、图7e、图7f可知，固定酶解时间、pH值、酶解温度，随着微波辐射时间的改变，多糖得率发生明显的改变，表明微波辐射时间对多糖得率的影响较显著；分析图7a—7f可知，酶解温度与pH值对多糖得率的影响较小，表现为随着该因素水平的改变，响应曲线变化较平缓。响应面分析试验结果与回归模型的方差分析试验结果一致，进一步表明了响应面优化模型能准确预测试验结果。

图7 各因素交互作用对多糖得率的响应面分析Fig.7 Response surface plots of different parameters interactions on the yield of polysaccharide

2.4.3 工艺条件优化

通过 Design-Expert 8.0软件对试验因素水平的分析，得到最佳工艺参数：酶解时间1.2 h，酶解温度58 ℃，微波辐射时间10 min，pH 4.0，此时五味子多糖得率14.92%。在此参数下平行操作3次试验，五味子多糖的平均得率为14.87%，与响应面所优化模型的理论预测值很接近，表明试验所采用的响应面优化得到的工艺参数准确度高。

2.5 不同方法提取五味子多糖的比较

为了对试验建立的提取技术进行准确评价，笔者亦采用其他现代技术和传统的回流法提取了北五味子多糖。根据文献报道的最佳工艺参数，分别通过微波辅助技术[14]、超声波法[15]、回流法[7]和纤维素酶法[16]4种方法提取多糖，每个方法平行试验3次，结果见表6。

表6 不同方法提取多糖的比较Table 6 Comparison of different methods for polysaccharide extraction

由表6可知,采用的5种提取方法中，北五味子多糖的得率呈现一定的差别，由高到低的顺序依次为微波辅助酶法>纤维素酶法>微波辅助热水回流法>超声波辅助法>传统热水回流法。此外，不同提取技术所需工艺参数各不相同：传统热水回流法提取温度最高，且耗费时间最多，提取长达5 h；纤维素酶法所需时间仅次于回流法，需要3 h；超声波法需3次提取，累计时间低于纤维素酶法；微波辅助法提取时间最短，仅需7 min便可完成提取。整体分析，与单一酶法提取技术比较，微波辅助复合酶法的提取时间较短，提取温度适中，且多糖得率明显提高，取得了较理想的提取效果。

将微波辅助复合酶法应用到了北五味子多糖的提取领域，该技术结合了微波辅助法和复合酶法的优点。通过先微波处理后复合酶的酶解作用，细胞破壁能力得到进一步加强，溶剂分子对药材基体的渗透和待提取成分的溶剂化急剧加速，显著促进了目标成分从细胞到提取溶剂中的传质作用。该技术相对于传统的热水回流法和单一酶提取法，不仅耗费时间短，而且目标成分得率高，是一种很有前景的多糖提取技术。

3 结论

探索了微波辅助复合酶萃取北五味子多糖的工艺条件。首先采用正交优化试验确定了复合酶由1%纤维素酶、2%木瓜蛋白酶和2%的果胶酶组成；然后设计响应面优化试验对微波辅助复合酶萃取法的工艺进行了优化，确定最佳参数：酶解时间1.2 h，酶解温度58 ℃，微波辐射时间10 min，pH 4.0。在此工艺下，五味子多糖平均得率为14.87%。与超声波辅助法、纤维素酶法和热水回流法3种提取技术相比，该新方法提取时间较短，能耗低，多糖得率高。微波辅助酶法充分结合了微波和复合酶两种提取方法的优点，细胞破壁能力强，目标成分扩散容易，传质快，且操作简单，能耗低，为工业化大量生产北五味子多糖提供了数据支撑和理论依据。