水飞蓟素诱导子宫内膜癌细胞凋亡的药理机制研究

华金仁，刘荣芳，叶婷婷，潘玫

伴随对子宫内膜癌认知的提升，其治疗方案也日渐完善，但对于晚期子宫内膜癌患者，仍需采用放疗、化疗等进行治疗，其中化疗已成为人们最为重视的一种治疗方法。对于部分特殊的患者，如手术治疗后具有较高复发风险或已复发的患者，则需在手术治疗后联合应用放化疗，以便能够更好地抑制癌细胞，降低其复发率，延长生存时间［1-2］。水飞蓟素为一种抗氧化剂，临床上广泛用于预防银屑病、胆管炎、脂肪肝等疾病，而且具有抑制宫颈癌、乳腺癌细胞分化生长的效果。为进一步明确其作用机制，本研究将水飞蓟素用于子宫内膜癌治疗中，评价其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 样本来源为上海复祥生物科技有限公司提供的人子宫内膜癌Ishikawa 细胞株，哈药集团生物工程有限公司提供的水飞蓟素注射液，杭州四季青提供的胎牛血清，GIBCO 公司提供的RPMI-1640 培养液，美国Sigma 公司提供的0.05%胰蛋白酶，武汉博士德生物工程有限公司提供的四唑盐（MTT）细胞增殖试剂盒和双抗（青-链霉素），北京康威士忌生物科技有限公司提供的兔抗人Caspase-3 多克隆抗体。仪器为北京市新技术应用研究所提供的超净工作台、二氧化碳恒温培养箱、光学显微镜，SANYO 公司提供的电冰箱，上海光学仪器厂提供的倒置显微镜、冻存管、酶联免疫检测仪、离心管，美国BD 公司提供的流式细胞仪。

1.2 研究方法 选取2019 年1 月—2020 年4 月江西省妇幼保健院收治的60 例子宫内膜癌患者，取患者的人子宫内膜癌Ishikawa 细胞株，对照组中不增加任何药物，观察组增加水飞蓟素，应用MTT 比色法检验水飞蓟素对子宫内膜癌细胞活性影响，使用流式细胞术检测细胞凋亡率，使用免疫组化法检验Caspase-3 表达水平。

1.2.1 细胞培养 取6 mg/ml 水飞蓟素注射液，以原液形式保存在4 ℃冰箱内，使用时稀释至所需浓度。将人子宫内膜癌Ishikawa 细胞株自液氮内取出，置入37 ℃ 水浴箱溶解，按1 000 r/min 离心5 min，取冻存液，置入预先配置好的浓度为10%胎牛血清和1%双抗RPMI-1640 培养基，混合均匀，于培养瓶接种细胞悬液，放于温度为37 ℃的环境中，保持恒温，以5%规格的二氧化碳培养箱进行培养，细胞贴壁后更换培养液，继续培养，培养至传代水平后，进行细胞冻存处理，待用。1.2.2 MTT 法检验水飞蓟素诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡情况 取数对生长期细胞，去除培养液后使用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，以0.05%胰蛋白酶进行消化，加入培养液，终止消化。调整细胞数，保持3 ×104个/ml，于96 孔细胞培养板上接种细胞混悬液，100 μl/孔。于培养箱（37 ℃、5%二氧化碳）中孵育，时间为24 h，此后丢弃上清液，设置含有细胞、培养基的对照组，与含50 μg/ml 的观察组，每个孔内加入150 μl 的药物，同时设置调零孔。放入培养箱中，时间为48 h，然后采用倒置显微镜仔细观察，结束后，于避光条件下，在每个孔内加入MTT 染色液10 μl，放置于培养箱中，时间为4 h。此后，每个孔加入溶解液100 μl 置入摇床上低速震荡半小时，充分溶解结晶物。在酶联免疫检测仪中测定各个孔的吸光度值。

1.2.3 人子宫内膜癌Ishikawa 细胞凋亡率检验 方法：流式细胞仪检验，操作流程：取数对生长期细胞制成单细胞悬液，接种在6 孔细胞培养板内，每个孔内加入2 ml药物制成的培养液，放置于培养箱中，设置对照组（不加入药物）、观察组（6 μg/ml），置入培养箱（37 ℃、5%二氧化碳）内，培养24 h 后去废液，以无菌PBS 洗涤2 次，再以0.05%胰蛋白酶进行消化，终止培养液。以1 000 r/min 离心5 min，结束后，丢弃上清液，加入BS重悬细胞2 ml，300 目尼龙网过滤，再次重复上述操作，调整细胞浓度为5×105个/ml。检验细胞凋亡率，获得细胞荧光信号（对数方式），搜集标本荧光信号（FL1、FL2 模式），并运用Cellquest 软件处理。

1.2.4 Caspase-3 表达水平 方法：免疫组化法检验，操作流程：对照组常规处理，观察组待检测标本，显色1～5 min 后，以切面苏木素复染，常规脱水、透明、干燥、封固（中性树胶），操作结束后，运用显微镜观察标本，阳性判定标准为：细胞质内有棕黄色颗粒。分数判定标准：依据阳性细胞数、染色深度，阳性细胞数＜1%者为0 分，1%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，≥76%为4 分。染色强度：无色则计0 分，浅黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分。二者相乘获得最终得分。

1.3 观察指标（1）观察对照组和观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞增殖以及细胞凋亡率的影响。（2）对比对照组和观察组人子宫内膜癌Ishikawa 细胞Caspase-3 表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据处理，计量资料以表示，比较采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组和观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞增殖影响 观察组人子宫内膜癌Ishikawa 细胞吸光度低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）。见表1。

表1 对照组和观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞增殖影响（）

表1 对照组和观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞增殖影响（）

2.2 对照组和观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞凋亡影响 观察组人子宫内膜癌Ishikawa 细胞凋亡率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）。见表2。流式细胞仪结果见图1、2。

图1 对照组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞凋亡影响

表2 对照组和观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞凋亡影响（，%）

表2 对照组和观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞凋亡影响（，%）

2.3 对照组和观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞Caspase-3 表达水平影响 观察组中人子宫内膜癌Ishikawa 细胞Caspase-3 表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）。见表3。

表3 对照组和观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞Caspase-3 表达水平影响（）

表3 对照组和观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞Caspase-3 表达水平影响（）

3 讨论

子宫内膜癌是女性生殖系统第三大恶性肿瘤，其发生率呈现出全球增长的趋势，对我国乃至全球女性生殖系统的健康均构成了威胁。

近几年来，随着学者对癌症的不断深入研究，各种癌症的治疗方案均取得了较为有效的进展，而妇科医学中，子宫内膜癌也取得了较好的效果，但仍需面临诸多问题，比如化疗药物敏感性等。肿瘤是由于各种活性氧、氧化鸟嘌呤，形成8-羚基鸟嘌呤，损伤DNA，进而使得染色体的转化发生变化而导致，运用抗氧化剂，尤其是自由基清除剂，可在一定程度上预防这一过程中的发生，进而达到治疗的目的［3-4］。水飞蓟素是一种抗氧化剂，是从乳蓟（Milk Thistle）中提炼出来，对于肝癌、前列腺癌、乳腺癌等多种癌细胞均具有较好的生长抑制、分化抑制的作用［5］。

图2 观察组对人子宫内膜癌Ishikawa 细胞凋亡影响

祖木热来提• 艾尼瓦尔等［6］认为，凋亡受阻极大可能是一种子宫内膜癌的发生机制，细胞凋亡可能存在负调节作用。子宫内膜癌组织内，Caspase-3 呈低表达状态，这一点可能是子宫内膜癌发生的原因之一［7］。细胞凋亡是细胞为了适应环境，而进行的一种主动过程，这期间涉及基因的激活、表达、调控等。Caspase 可激活生物化学途径，参与细胞凋亡，因而认为Caspase 激活与细胞凋亡存在密切关联性，Caspase通过有序、多步水解过程活化，在这一过程中，目前已发现Caspase-3、Caspase-7 等均执行了细胞凋亡任 务［8-9］。细胞凋亡过程为多种基因控制，比如Caspase家族、抑癌基因等，因而细胞凋亡是多种过程导致的，故而癌症可能与多种疾病产生直接、间接关联，诸如：癌症、免疫系统、内分泌疾病等［10-11］。水飞蓟素对人胃癌SGC 7901 细胞增殖、迁移和侵袭有抑制作用［12-15］，因而本研究通过水飞蓟素诱导细胞凋亡情况，观察子宫内膜癌细胞变化，结果提示：水飞蓟素可诱导人子宫内膜癌Ishikawa 细胞凋亡，且使用水飞蓟素作用于人子宫内膜癌Ishikawa 细胞48 h 后，细胞内Caspase-3 表达水平明显高于对照组，可见水飞蓟素不但可诱导人子宫内膜癌Ishikawa 细胞凋亡，且细胞凋亡率较高，Caspase-3 表达水平升高。鉴于此，笔者推测可通过上调子宫内膜癌患者体内Caspase-3 表达水平，调控子宫内膜癌细胞凋亡。

综上所述，在子宫内膜癌的发生过程中，水飞蓟素可诱导癌细胞凋亡，机制可能是通过上调患者体内Caspase-3 表达水平实现。但其发病机制和进展过程的具体作用方式有待更多研究，以帮助减轻由氧化应激、炎性反应等因素给疾病进展带来的不良后果，同时为子宫内膜癌的临床治疗提供更多的基础研究。