不同提取方法对食蟹猴粪便中结肠小袋虫PCR检测的影响

贺会利，谢永平*，庞彬辉，毛素梅，曾 飞

(1.广西兽医研究所，广西南宁 530001；2.广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001；3.广西桂东灵长类开发实验有限公司，广西梧州 543100)

食蟹猴(machin)属于灵长目(Primate)猴科(Cercopithecidae)猕猴属(Macaca)。由于其遗传基因与人类的遗传基因相似度可达98.5%，同时具有体型较小、性格温顺等优点，因此常被作为国内外重要的实验动物研究模型[1]。随着世界科学研究中对试验结果的准确度要求不断提高，对试验用猴的需求增多的同时对质量的要求也越来越高，但一些国家限制了食蟹猴的出口，导致实验动物的流通数量不断减少，这加速了广西食蟹猴养殖业的发展[2]。在各种疫病中，寄生被认为是最重要的问题[3]。食蟹猴感染寄生虫后对自身造成了生理、生化以及免疫学指标的变化，对试验结果的准确性造成一定的干扰，为了提高实验猴质量和养殖场的经济效益，必须加强对猴群寄生虫的控制与净化。

结肠小袋虫(Balantioidescoli，B.coli)属于纤毛虫门、动基裂纲、毛口目、小袋虫科、小袋虫属，1857年首次从人体的粪便中发现该虫体[4]。B.coli发育的过程中有滋养体和包囊两种形态。滋养体主要以横二分裂法增殖，虫体极易变形，在不利的环境中形成包囊，包囊可在室温条件下存活2月之久[5]，包囊不易受环境压力影响，是病原体的传播阶段。由于结肠小袋虫产生蛋白水解酶，会损伤结肠黏膜，虫体利用损伤部位侵入肠壁[6]，寄生在动物肠道，导致动物机体腹泻、结肠充血、出血、溃疡和穿孔等，结肠小袋虫是一种危害较大的人畜共患寄生性原虫，必须给予足够的重视[7]。目前认为猪是主要的传播源，主要流行于热带和亚热带地区，可感染包括人在内的30多种动物，人感染后可造成肠道溃疡，甚至可转移至呼吸道、尿生殖道、盆腔等部位寄生，造成坏死性肺、尿道感染、子宫阴道炎症、膀胱炎等[8]。

粪便检查对于诊断寄生虫病有着非常重要的意义，对粪便样品进行人工镜检法是目前寄生虫检测常用的方法，但由于标本量多，镜检速度较慢，易对操作者造成眼疲劳，并且存在一定的生物安全问题，因此常规的粪便检查方法亟待改善[9]。近年来，随着现代分子生物学技术的发展，聚合酶链反应(PCR)因其较高的敏感性、特异性及能够提供病原体在体内存在的直接证据，在其诊断中展示了广阔的应用前景[10]。人们能直接从DNA分子水平上来对寄生虫进行相关研究，从而避开了显微镜观察的过程。因此，获得高质量的总DNA就成为这些研究的必要前提。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集和处理 广西地区食蟹猴饲养场新鲜的腹泻猴粪样品，采集后立即镜检，确定是否有结肠小袋虫滋养体和包囊。

1.1.2 试剂 粪便基因组DNA提取试剂盒、通用型柱式基因组DNA提取试剂盒、蛋白酶K、酚、氯仿、异戊醇、2×TaqMasterMix (Dye)、DNA Marker DL 2000、磷酸盐缓冲液(PBS)、TE缓冲液、十二烷基硫酸钠(SDS)、酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)、无水乙醇，北京康为世纪生物科技有限公司产品；植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，上海捷瑞生物工程有限公司产品；BIOWEST凝胶琼脂，GENE公司产品。

1.1.3 仪器 PCR仪，天根生化科技(北京)有限公司产品；凝胶成像系统，自Bio-Rad公司产品；超微量核酸蛋白分析仪，五洲东方公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank中已经发表的结肠小袋虫序列(登录号：MG837094.1)，利用Oligo7软件设计PCR引物，具体引物信息见表1。引物由广州华大基因科技有限公司合成。

表1 引物

1.2.2 粪便中结肠小袋虫DNA的提取 应用3种不同的商品化的试剂盒，按照试剂盒说明书提取样品中的DNA，经典酚-氯仿法参考李霞[11]等人的操作方法进行提取。每种方法每个样品重复3次，提取的DNA置于-20℃保存，用于核酸含量以及分子检测。

1.2.3 DNA含量的测定 采用核酸核酸蛋白分析仪分别对通用型柱式基因组DNA提取试剂盒，植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，粪便基因组DNA提取试剂盒和经典酚-氯仿法4种方法抽提的DNA含量进行测定，重复3次。

1.2.4 PCR扩增 以DNA为模板，应用上述PCR引物(xmc-F/xmc-R，本实验室保存)进行PCR扩增，其PCR体系为25 μL，分别为2×TaqMasterMix 13 μL、ddH2O 7 μL、引物各1 μL、模板DNA 3 μL。PCR扩增反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。

1.2.5 电泳及测序 将PCR扩增产物在15 g/L 的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后将有目的条带的PCR产物进行胶回收、克隆、测序，准确后用试剂盒进行提取质粒。

2 结果

2.1 核酸含量测定结果

采用核酸核酸蛋白分析仪分别对通用型柱式基因组DNA提取试剂盒，植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，粪便基因组DNA提取试剂盒和经典酚-氯仿法4种方法抽提的DNA含量进行测定，均值分别为25.6、32.9、42.05、12.3 ng/μL。

2.2 DNA电泳检测结果

将PCR产物进行凝胶琼脂电泳，如图1所示，获得了以下结果。

M.DNA标准DL 2 000；1.通用型柱式基因组DNA提取试剂盒；2.植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)；3.粪便基因组DNA提取试剂盒；4.经典酚-氯仿法；5.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000；1.Universal genomic DNA kit；2.Plant genomic DNA kit；3.Stool genomic DNA kit；4.The phenol-chloroform extraction method；5.Negative control

2.3 临床应用结果

利用粪便抽提试剂盒对68份广西地区采集的腹泻粪便进行DNA提取，12份为结肠小袋虫阳性，与镜检结果进行对比验证，结果显示两者的符合率为100%(图2)。

M.DNA 标准 DL 2 000；1～22.临床样品检测编号；23.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000；1-22.Clinical samples；23.Negative control

3 讨论

近年来随着动物医学和生物学的大力发展，对实验猴的需求量增加，同时对其等级质量要求也在提高，广西因其优越的地理位置及环境，成为全国人工养殖量最多的食蟹猴养殖基地，对其但随着试验猴集约化养殖程度的提高，寄生虫感染状况也日益凸显，食蟹猴感染寄生虫后对自身造成了生理、生化及免疫学指标的变化，对试验结果的准确性造成一定的干扰[12]。研究发现，试验用猴结肠小袋虫感染率为3.27%[13]。结肠小袋虫感染动物机体后可使自身免疫力下降，导致结肠小袋虫的大量繁殖，造成饲料的转化率下降，并且容易继发细菌或病毒感染，加重病情，严重时可致动物死亡，并传播感染其他动物，给养殖业造成一定的经济损失。

在非损伤性取样材料中，动物粪便作为分析样品，提取其DNA进行遗传分析和分子生态学研究具有较好的实际意义和应用价值[14]。自1992年粪便DNA分析技术逐步发展起来，发展了多种粪便DNA提取方法，也证实了粪便DNA分析技术的稳定性和可行性[15]。但仍存在很多问题，首先，由于粪便材料的特殊性，粪便中动物细胞分布不均，粪便中DNA含量少，容易降解[16]，并且其成分比较复杂，含有大量末消化的食物残渣、胆碱等杂质成分[17]，因粪便中干扰因素多，增加了样品DNA的提取和基因扩增的难度，甚至增加基因分型的错误率等[18]。其次，物种和个体之间的差异导致各种提取方法通用性不好，致使试验中存在扩增成功率低。再次，从粪便中提取总DNA的方法众多，采用不同的提取方法获得的DNA含量和纯度也不同[19]。提取结果受到多重因素的影响，如样品的采集的方法、保存的条件等等，忽视其中任何一个环节，都会给试验结果带来不利影响甚至导致试验失败，进而影响后续试验，这是阻碍粪便DNA提取技术推广的主要原因。故基因组DNA的成功提取及稳定的PCR反应体系的建立成为开展该方面研究的前提。因此，针对不同的动物应选取不同的提取程序，并加以适当的改进。选择构建一套效果好、通用性好、性价比高的粪便样品总DNA提取方法相当重要，可以大大推进粪便DNA诊断技术的推广。

为了比较不同抽提方法对结肠小袋虫DNA的提取效率和质量及对结肠小袋虫PCR检测的影响，本试验采用3种商品化基因组DNA提取试剂盒和经典酚-氯仿法，分别对粪便样品进行DNA提取，测定浓度，作为模板，进行PCR检测，观察不同抽提方法提取DNA的扩增效果。结果显示，4种提取方法均能扩增出目的条带，粪便抽提试剂盒的PCR扩增效果最好，通过此方法获得的DNA含量达到42.05 ng/μL。王宏等[20]通过采用粪便基因组DNA提取试剂盒对猕猴的新鲜水样粪便进行基因组DNA的提取，测得DNA质量浓度也达到40 mg/L以上。单磊等[21]也证实商品化的抽提试剂盒具有一定的优越性。同时利用粪便抽提试剂盒对68份广西地区采集的腹泻粪便进行DNA提取，进行PCR检测，结果显示阳性率为17.65%(12/68)，与镜检结果相一致。