腐生丝状嗜热真菌分泌的嗜热纤维素水解酶研究进展

张正盈，江贤章

（福建师范大学生命科学学院，福建福州 350117）

嗜热真菌是一类在45～50 ℃高温环境下生长良好的真菌。对嗜热真菌分泌的酶进行研究，主要是为了研究他们在生物技术过程中的适用性，并探索常温真菌和嗜热真菌的酶在理化性质上的差异。腐生丝状嗜热真菌是嗜热真菌的一个重要分支。腐生丝状嗜热真菌被认为是嗜热酶的良好来源。腐生丝状嗜热真菌的基因组在编码区的GC含量高于中温真菌的GC含量，这一变化集中反映在密码子的第三位。由于这一变化，腐生丝状嗜热真菌产生的嗜热酶具有高温适应性和热稳定性，高催化活性，可以更强地抵抗变性剂并降低污染的发生率，对富含油脂、重金属、植酸和多糖等的工业废物和废水具有生物修复作用。腐生丝状嗜热真菌可以用来生产淀粉酶、磷酸酶（包括植酸酶）、纤维素水解酶、蛋白酶等酶类。这些酶在食品、纺织和洗涤剂、乳品、制药等工业中都有应用。本文对腐生丝状嗜热真菌分泌的三种主要嗜热纤维素水解酶的应用以及分子领域的研究现状的最新信息进行了综述，使腐生丝状嗜热真菌更好地应用于生物技术的研究工作。

1 嗜热纤维二糖脱氢酶

纤维二糖脱氢酶（CDH）又被称为纤维二糖氧化酶，是一类黄素血红素蛋白；1974年由Eriksson等人最早从Sporotrichum pulverulentum中发现，其相对分子量约为90 kDa，是一种对于pH和温度较稳定的酶。在应用上，CDH可以提高纤维素酶的降解效率。嗜热CDH的克隆和测序显示该酶有3个结构域：一个含催化位点的N-terminal黄素结构域、中间血红素结构域以及与里氏木霉的纤维素酶结合结构域同源的C-terminal结合结构域[1]。基于CDH序列分析，定义了四个系统发育类。这些类中CDHs在纤维素结合、底物特异性以及催化反应中结构域之间的电子转移方面表现出不同的结构和催化性能。在之后的研究中对Ⅰ类和Ⅱ类CDH的结构、反应机理和动力学进行了详细的表征。CDH的重组表达在生物传感器、生物燃料电池、生物质水解及合成过程等多个领域得到应用。腐生丝状嗜热真菌产生的嗜热性纤维二糖脱氢酶具有更好的酶活性以及热稳定性，嗜热纤维二糖脱氢酶在纤维素聚合、减少纤维素产物抑制以及抑制纤维素重聚合等方面都起到一定作用，可以进一步优化纤维素酶对于纤维素的降解作用。挖掘腐生丝状嗜热真菌中优质嗜热纤维二糖水解酶，将在工业生产中具有巨大的应用前景。

2 嗜热木聚糖酶

木聚糖酶（Xylanase）是一类降解木聚糖中β-1,4木糖苷键的酶系，对大量存在于自然界中的半纤维素具有重要作用。木聚糖酶普遍存在于甲壳类动物、植物、微生物中。现如今，已测定了许多木聚糖酶基因完整的序列，如枯草杆菌W23的木聚糖酶基因序列。腐生丝状嗜热真菌产生的嗜热木聚糖酶在工业纸浆生物漂白中具有一定优势而受到关注。研究发现，从木质素-碳水化合物复合物中除去木聚糖从而促进木质素的浸出，消除了在纸浆漂白过程中对氯的需要[2]。另外，嗜热木聚糖酶能使木质纤维素紧密吸附，具有较强的纤维素降解能力。嗜热厌氧菌（Caldicellulosiruptor bescii）产生的嗜热木聚糖酶属于GH10家族，其底物特异性广泛，有利于木质纤维素降解；嗜热木聚糖酶也可用于动物饲料的预处理，以提高其消化率。一些经过纯化的嗜热木聚糖酶的结构已经被确定，并通过结晶进行结构分析。

3 嗜热纤维素酶

木质纤维素是自然界中含量丰富的可再生资源，具有重要的经济意义。纤维素酶是一类将纤维素降解为寡糖或葡萄糖的蛋白质，由多种水解酶构成，由内切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucosidase，EG）、外切葡聚糖酶（exo-1,4-β-D-glucosidase，CBH）、β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）的协作来实现从纤维素到单糖的转化。利用纤维素酶将木质纤维素转化为增值产品是一种重要的策略[3]。在较高的温度下，纤维素会膨胀，更容易断裂。嗜热纤维素酶目前成为高效降解生物质的关键酶。

腐生丝状嗜热真菌中含有种类丰富的纤维素酶。李多川等[4]克隆了嗜热毁丝菌和嗜热毛壳菌的cbh1基因和eg2基因，在毕赤酵母中进行异源表达，构建了pPIC9K-cbh1和pPIC9K-eg2表达载体，并通过不断筛选获得具有更高活性的嗜热纤维素酶[5]。Jiang等人[6]评估了嗜热毛壳菌（C.thermophilum）的木质纤维素降解能力，并将其与里氏木霉（Trichoderma reesei）的木质纤维素降解能力进行了比较。结果显示，嗜热毛壳菌显示出更高的纤维素利用效率，而纤维素酶的产量相对较低，表示嗜热毛壳菌中可能存在更好的纤维素酶。对两种菌的主要纤维素酶纤维二糖水解酶Ⅰ（CBH1）进行比较，发现嗜热毛壳菌的比活性比里氏木霉CBH1高约4.5倍。为了探讨提高里氏木霉的CBH1活性是否有助于提高里氏木霉整体纤维素的利用效率，用嗜热毛壳菌cbh1基因替代了里氏木霉cbh1基因。数据表明，该基因置换不仅使纤维二糖水解酶Ⅰ（CBH1）的活性增加了约4.1倍，还导致了其他纤维素酶基因的更强诱导作用。

4 展望

腐生丝状嗜热真菌在热休克、氧化应激、膜生物合成、染色质结构和修饰以及真菌细胞壁代谢等嗜热酶生产过程中存在差异，其主要原因尚不清楚。近年来，随着生物能源市场需求的增加，对新型和改造后的工业酶以及高效酶的生产系统的探索逐渐深入。遗传系统建立方面的研究成为目前研究的一个重要方向。许多细菌和真菌本身的产酶效果不理想，但是可以通过构建遗传系统平台，作为活性酶的遗传库。腐生丝状嗜热真菌在作为遗传宿主上具有应用以及开发潜力。开发腐生丝状嗜热真菌遗传操作系统将极大地提高嗜热酶的产量以及嗜热酶的利用效率。

5 结语

利用腐生丝状嗜热真菌开发基因遗传表达工具，使腐生丝状嗜热真菌在生理条件下直接组装并产生耐热大分子复合物成为可能。该方法具有从腐生丝状嗜热真菌中获得复杂嗜热酶的巨大潜力，包括天然蛋白和RNA修饰。此外，这些嗜热酶复合物具有的热稳定性将有助于蛋白质之间的相互作用。因此，该方法不仅可以为腐生丝状嗜热真菌进一步发展成为生化模式生物提供基础；并对复合嗜热酶的结构进行预测分析提供可能。在腐生丝状嗜热真菌中开发基因遗传表达工具将在生物技术方面成为一条崭新的道路。