Nanopore测序技术在临床中的应用进展

黄丹，陈曦，刘燕

（赣南医学院，江西赣州 341000）

基因组携带了个体的全部遗传信息，通过对基因组测序可以帮助人们加深对疾病分子机制的理解，同时基因组测序在诊断与治疗方面也发挥着重要作用。在人类基因组学计划完成后，基因测序技术发展迅猛，其在临床实践和基础研究中的应用更加广泛。二代测序（Second-Generation Sequencing，SGS）技术凭借其高通量、高准确率和低成本的特点，成为当前主流的测序技术。但是随着研究的深入，二代测序技术的短读长（＜450 bp）增加了后续数据分析和基因组拼接的难度，也限制了该技术在未来研究中的应用[1]。近年来出现的第三代测序仪（Next-Generation Sequencing，NGS）——纳米孔测序仪（MinION），很好地弥补了这些缺憾。MinION的测序系统可以一次性获得的最大读长为882 kb[2]。不同于SGS“边合成边测序”的方法，纳米孔（Nanopore）测序是采取“边解链边测序”的方法[3]。MinION进行测序时需要测序芯片Flow Cell，每张芯片上有512个传感器，每个传感器上连接4个纳米孔，总计2 048个纳米孔，并由专门的集成电路控制。MinION的核心部件是由蛋白质构成的小孔，被称之为“pore”，这个pore被设置在一层电阻率很高的薄膜当中，薄膜的两侧都浸没在含有离子的溶液中。在薄膜的两侧加上不同的电位，离子就会通过蛋白质小孔，从膜的一侧移动到膜的另一侧。测序开始后，在文库制备过程中DNA末端被接上了特殊的Y形接头，可被纳米孔蛋白的DNA聚合酶所捕获，DNA聚合酶将双链DNA打开并引导其中一条单链穿过纳米孔。不同碱基在经过通道时，引起不同的电流干扰振幅被传感器记录下来，经过算法被电脑记录为不同的碱基字符[4]。DNA聚合酶被固定在零透光率的管制微池底部，并与单链DNA结合；当不同色基标记的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）游离到微孔底部时即刻整合进延伸中的DNA链，其与焦磷酸极端连接的色基在激发激光作用下发光并被记录，然后游离到环境中[5]。

相对于其他测序平台，MinION具有便携简单、超长读长及实时监控测序数据等优点，该设备的优点使其广泛应用于各个领域。如表1所示，Nanopore测序在各大领域有着突出的表现，本文将对这一测序技术在临床相关领域中的应用进行介绍。

表1 Nanopore测序技术的临床应用

1 临床病原微生物鉴定

人体许多疾病的发生与微生物系统的失调或者微生物的入侵有着极其紧密的关系，当前针对临床病原微生物的Nanopore测序主要包括宏基因组测序（metagenomic Next Generation Sequencing，mNGS）及全基因组测序（Whole-Genome Sequencing，WGS）。

宏基因组测序是对单个样品中获得的所有核酸进行测序，通过分析所有微生物核酸信息来深入了解样本中的微生物组构成，并寻找相关致病微生物。利用无组装的Nanopore对病毒进行宏基因组测序将有助于全面了解病毒基因组的结构及其变异，并能够准确地对病毒及寄生虫的性质和流行情况进行分析[6-7]。MinION被用于呼吸道病原体的快速检测具有同时检测出多种病原体并对病原进行分型的能力，但仍有一些技术问题需要解决。如在快速检测背景下，人的临床样本，尤其是咽拭子、血液、尿液等样本，其宿主核酸含量占比一般较高，病原体核酸含量极低，导致测序数据中宿主相关序列占绝大部分，能否去除样本中大量的宿主核酸成为宏基因组测序成功与否的关键[7-8]。基于皂苷可以有效去除99.99%的宿主DNA， Charalampous等[9]开发了一种用于细菌性下呼吸道感染（Lower Respiratory Infection，LRI）诊断的宏基因组学方法。基于Nanopore测序，病原体检测的敏感性和特异性均显著提升，同时可检测出抗生素抗性基因。而且Nanopore宏基因组学可以快速准确地鉴定细菌LRI，有助于减少广谱抗生素的使用。

全基因组测序是指在无参考序列情况下，凭借生物信息学分析方法直接对物种序列进行拼接、组装，最终获得该物种的基因组图谱。全基因组测序有助于人们深入了解物种的基因组成及分子进化，但是相邻区域之间重复序列的干扰是组装过程中的一大阻碍。Moss等[10]提出一套测序流程（Lathe）：结合长读长序列组装和短读长序列纠错，可以从复杂的微生物群落中组装完整的基因组。使用Nanopore测序共获得了30.3 GB数据，这些数据包含了全部12种细菌。12个细菌中共有7个组装成完整基因组，另外3个基因组被组装成4个或更少的片段，组装程度最差的细菌基因组包含单个片段中83%的基因组。以上结果表明：Nanopore测序组装结果比二代测序更具有连续性。虽然与其他测序和组装方法相比，核苷酸的准确性有所下降，但该方法提高了组装的连续性，在研究生物功能尤其是重复原件的作用等方面具有广阔的应用前景。

2 临床病原微生物耐药诊断

病原体通过基因突变而获得对抗生素的耐药性，对临床治疗造成了极大的影响。当前，临床上主要采取抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Testing，AST）进行微生物耐药诊断。但是AST标准方法存在一些缺陷：（1）AST结果通常需要在临床完成采样后48～72 h生成，这对患者及时接受抗生素治疗是一大阻碍；（2）现在投入临床使用的自动AST面板所包含的抗生素数量有限，无法识别新发现且具有治疗意义的耐药菌；（3）标准的AST报告不包括耐药机制的鉴定，如超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-lactamase，ESBL） 等[11]。Tamma等[12]使用Nanopore对40例临床肺炎克雷伯菌复杂菌株进行测序及组装，基因型测序分析结果和AST结果一致性高达92%。从培养分离株到获得完整的抗生素耐药（Antimicrobial Resistance，AMR）基因仅用时8 h，在14 h时可以检测到更多的耐药基因，如氟喹诺酮类、氨基糖苷类和多合蛋白（mcr-1及其变体）。Wang等[13]利用Nanopore对肺炎患者的临床微生物进行测序，并全程指导临床抗生素治疗，使患者获得及时有效的治疗。同时，Tafess等[14]利用Nanopore测序对临床结核病人的双歧杆菌耐药基因进行分析，结果显示：与表型药物敏感性试验（phenotypic Drug Susceptibility Test，pDST）相 比，Nanopore测序分析的平均临床敏感性和临床特异性分别高达94.8%和98.0%，而整个测序耗时仅为15 h，并且可以比pDST至少提前17～18 d提供治疗指导。Nanopore测序不仅可以靶向检测耐药基因的突变，还能给临床用药提供及时的指导意见，同时也能为患者的愈后情况提供预估标准[15-17]。测序平台的高通量、高输出、高效率对于实时监测提供了巨大的临床价值。

3 肿瘤诊治中的应用

随着分子技术的进步，将肿瘤进行分子分型已经成为临床诊断、治疗指导及预后评估的重要手段。例如，针对中枢神经系统肿瘤，世界卫生组织明确要求进行分子检测并进行分子分型，如1p/19q共缺失或异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变[18]。目前，基因组测序主要局限于耗时过长，对于临床早期诊断是一大障碍。Euskirchen等[19]利用Nanopore测序对28例脑肿瘤样本进行全基因组测序，测序结果显示：与NGS相比，Nanopore测序准确性较差，但是在采样当天即可出具同样起到诊断作用的测序报告。同时其研究结果表明，Nanopore测序对表观遗传修饰和单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNV）进行当天诊断是可行的。Minervini等[20]利用纳米孔MinION技术的深度测序对BCR-ABL1阳性白血病进行突变分析，将测序结果与Sanger法测序结果进行对比，发现其结果的一致性达到92%。此外，纳米孔测序还检测出两例Sanger测序为阴性的低水平突变样本。Nanopore测序技术不仅准确检测到了耐药患者存在BCR-ABL1融合突变，还突显出识别潜在的低水平变体和区分“复合突变体”的优势。此外，研究人员巧妙地利用crispr-cas9靶向切割的原理将目的片段进行靶向捕获，按照Minervini的方法对目的序列进行富集，在低通量的情况下得到目的序列。相对传统的融合基因检测特异性需要针对已知融合类型的检出，该方法可以不需要知道融合基因中具体的融合伴侣进行融合基因检测，并且可以发现未知融合，这对于肿瘤融合基因检测技术是巨大的进步。

4 遗传性疾病的诊断与检测

遗传病是指由遗传物质发生改变而引起或者是由致病基因所控制的疾病，具有先天性、终生性和家族性，且具有病种多、发病率高等特点。基因组变异主要分为SNV、插入缺失（Indel）、结构变异（Structural Variants，SVs）三大类。其中SVs通常指基因组上大的序列变化和位置关系变化，包括长度在50 bp以上的长片段序列插入或者删除、串联重复、染色体倒位、染色体内部或染色体之间的序列易位、染色体变异以及形势更为复杂的嵌合性变异。结构变异的检测技术有多种，其中以短读长测序为基础的WES（Whole Exome Sequencing，全外显子组测序）/WGS检出率有限（不足50%），这是由于短读长测序技术无法可靠地鉴定重复区域或难以覆盖到高GC含量的区域，而Nanopore测序具有超长读长（目前最长为2.4 MB）、无GC偏好性、直接检测甲基化等优势，能够跨越重复序列从而克服短读长测序在鉴定遗传病SVs中所面临的挑战。目前，利用纳米孔长读长测序解析遗传病的结构变异已有很多案例，如Miao等[21]采用Nanopore测序技术在一例WES阴性的患者中精准鉴定出SVs。发现先证者G6PC基因的外显子1和2的缺失，杂合性缺失导致患病，不仅对患者进行了确诊，还明确了结构变异的来源。Zhang等[22]使用Nanopore测序找到平衡易位准确断点，用于第三代试管婴儿进行胚胎筛选，确定胚胎是否是倒位、平衡易位携带者，从而为胚胎植入前遗传学诊断（Preimplantation Genetic Giagnosis，PGD）提供了重要参考。Deng等[23]和Ishiura等[24]则利用Nanopore长读长测序技术，解析出了短读长无法获得的家族性皮质肌阵挛性震颤伴癫痫患者重复序列以及神经元核内包涵体病（Neuronal Intranuclear Inclusion Disease，NIID）的变异位点。相对于目前的IS-PCR、MLPA+巢式PCR、短读长测序等复杂且繁琐的检测方法，Nanopore长读长测序作为现有基因诊断技术的有效补充技术，能够一次性完成结构变异检测，同时检测倒位和点突变等变异，适用于染色体平衡易位的断裂点诊断、有假基因的单基因遗传病诊断、有复杂重复序列的单基因遗传病诊断、有复杂的基因组结构变异的单基因遗传病以及甲基化相关的遗传病诊断。

5 结语

以Nanopore测序技术为代表的三代测序平台在精准性上比二代测序平台低，在实际应用中的推广依然存在着一定的阻力，同时由于是新兴技术，各类试剂的更迭及分析方法的更新对研究人员有着更高要求；然而其在临床微生物病原学检测、感染相关病原体的诊断、肿瘤学研究以及遗传性疾病的检测等方面都有着不俗表现，这也为相关的学科研究提供了新的思路与技术，Nanopore测序也将在更多的领域呈现更大的临床与研究价值。