N6-甲基腺苷修饰在卵母细胞发育过程中作用机制的研究进展

李艳梅，王乃辉，孙小燕，张学红

(1.兰州大学第一医院，兰州 730000；2.兰州大学第一临床医学院，兰州 730000；3.甘肃省生殖医学与胚胎重点实验室，兰州 730000)

近年来，真核生物中发现的RNA修饰已超过150多种，其中N6-甲基腺苷(m6A)是最常见、最丰富和最保守的修饰方式，并且以一种动态、可逆的方式调节细胞内mRNA的甲基化水平[1]。甲基转移酶、去甲基酶和甲基结合蛋白共同调节m6A的动态可逆修饰。其中，m6A甲基转移酶包括：甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(METTL14)、Wilms肿瘤抑制因子(WT1)相关蛋白(WTAP)、RNA结合基序蛋白15(RBM15)、类病毒m6A甲基转移酶(VIRMA/KIAA1429)，称为“写入者”(Writer)；去甲基化酶包括：脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)、ALKB同源物5(ALKBH5)，称为“擦除器”(Eraser)；m6A甲基结合蛋白包括：YTH结构域家族蛋白(YTHDC1/2、YTHDF1/2/3)、胰岛素样生长因子mRNA结合蛋白(IGF2BP1/2/3)，称为“解读器”(Reader)。越来越多的证据表明，m6A修饰通过影响RNA的正常代谢过程，如剪接[2]、翻译[3]、稳定[4]和降解[5]等，从而参与调控多种疾病的发生发展[6-8]。

卵母细胞发育过程分为生长、成熟和排卵3个不同的阶段。生发泡破裂(GVBD)通常被认为是卵母细胞成熟的一个标志。在哺乳动物中，卵母细胞停滞在减数分裂前期直到青春期，然后，在神经、激素和分子信号的联合调控下，发育成熟的生发囊泡卵母细胞(GV)恢复减数分裂并发生GVBD；随后，同源染色体配对，微管在减数分裂中期Ⅰ(MI)组装成双极纺锤体，同源染色体附着于纺锤体并在纺锤丝的牵拉下作为第1极体从卵母细胞排出，完成第1个减数分裂周期；之后，卵母细胞进入第2个减数分裂周期，并在减数分裂中期Ⅱ(MⅡ)再次停止；经过精子受精或孤雌激活后，卵母细胞再次恢复并完成第2次减数分裂，继续早期胚胎发育。既往研究显示，正常甲基化参与细胞的减数分裂过程，甲基化发生改变可影响减数分裂过程并改变细胞命运[9-10]。卵母细胞作为雌性生殖细胞，其发生和成熟过程的顺利进行对后续合子、胚胎和子代发育都有重大意义。

m6A甲基转移酶、去甲基酶和甲基结合蛋白的相关成员在卵母细胞的生长、成熟过程中所起的作用机制有很多研究进展，现综述如下。

一、m6A甲基转移酶对卵母细胞发生的影响

1.METTL3：是第1个被鉴定的m6A甲基转移酶，其在酵母和人类中高度保守。METTL3在各个发育阶段的卵母细胞的细胞核和细胞质中均可被检测到，GV期卵母细胞中METTL3主要定位于细胞核。METTL3通过影响性激素合成和纺锤体形成过程中的关键基因表达来影响卵母细胞的成熟。敲除小鼠胚胎干细胞中的Mettl3后会阻碍胚胎干细胞分化，并导致早期胚胎致死[11]。将Mettl3 siRNA微注射到小鼠GV期卵母细胞后，虽然卵母细胞减数分裂正常，但是后续第1极体排出率显著降低，卵母细胞中Cltc、Pcnt、Spdl-1和Msy2的mRNA相对表达量均显著升高，而Western blot却显示各蛋白丰度降低[12]，表明Mettl3 siRNA处理后GV期卵母细胞内Cltc、Pcnt、Spdl-1和Msy2的翻译效率降低。有研究发现，Cltc、Pcnt、Spdl-1和Msy2在小鼠卵母细胞纺锤体形成和染色体重组过程中起到了重要调控作用[13-14]。成年雌性Mettl3突变(Zmettl3m/m)斑马鱼的m6A水平降低，卵泡中Npr、Igf3、Star、3βhsd和Cyp19a1a的表达量显著降低，垂体中Lh、Npr和Igf3的表达量显著降低[15]。Tang等[16]研究发现，Lh、Npr和Igf3对雌性斑马鱼卵母细胞的成熟和排卵有刺激作用。Fsta可抑制HCG诱导的卵母细胞成熟，Zmettl3m/m斑马鱼卵泡中Fsta的表达水平显著增加[15]。由此可见，卵母细胞的成熟由多个环节协同作用，而METTL3在体内通过多个途径影响卵母细胞的生长、成熟，一旦功能缺失就会导致卵母细胞早期发育停滞。

2.METTL14：与METTL3一样，METTL14也是甲基转移酶的核心成员。在“写入”甲基的过程中，METTL3起催化作用，METTL14则促进甲基转移酶复合物与RNA结合。有报道发现，在猪卵母细胞中抗坏血酸可能通过抑制METTL14的表达而降低MII期m6A的整体水平，进而影响细胞周期和细胞发育[17]。然而，METTL14对卵母细胞生长发育具体的作用机制还有待今后进一步深入研究。

3.WTAP：是一种与剪接因子共定位的核蛋白，可与WT1特异性结合，在细胞功能和癌症(如上皮性卵巢癌)进展中发挥重要作用[18]。WTAP作为m6A甲基转移酶复合物的重要成员，WTAP和RBM15均为依赖于METTL3和METTL14的调节蛋白。环亮氨酸是一种蛋氨酸腺苷转移酶抑制剂，可通过降低S-腺苷蛋氨酸的浓度而降低整体m6A水平。有研究发现，将猪的卵丘复合体(COCs)在环亮氨酸中暴露24 h后，卵丘细胞的扩张受到抑制、GVBD率显著下降、阻滞减数分裂过程使MI期细胞增加，同时，WTAP表达也显著增加[19]。

4.KIAA1429：KIAA1429是一种新鉴定出的m6A甲基转移酶，通过调节选择性剪接参与卵母细胞的发育和减数分裂。在引导m6A在mRNA的区域选择性沉积中发挥关键作用[20]。据BioGPS数据库统计，Kiaa1429在小鼠卵母细胞中高表达[21]，表明它可能是卵母细胞某一特定功能的关键因子。Hu等[22]研究发现，当小鼠卵母细胞特异性缺失Kiaa1429(Kiaa1429Zp3cKO)后，小鼠卵泡发育停滞在初级卵泡期，卵母细胞GVBD失败。在卵母细胞中KIAA1429定位于核斑，核斑中富含pre-mRNA处理因子和参与选择性剪接的因子[23]。当卵母细胞中Kiaa1429缺失后，YTHDC1位点数量显著减少，说明卵母细胞中KIAA1429对核斑中特定mRNA处理因子的定位具有重要作用。

二、m6A去甲基酶对卵母细胞发生的影响

1.FTO：FTO是第1个被报道的m6A去甲基酶[24]，在卵母细胞内定位于核斑和细胞质。与对照组相比较，卵巢功能不全(POI)患者的卵巢组织和卵巢颗粒细胞中FTO的转录和翻译水平均显著降低，细胞增殖显著降低而凋亡显著增加[25]。Sun等[26]研究发现，不孕症患者卵泡液和颗粒细胞中FTO的表达水平随着患者卵巢衰老程度增加而逐渐降低，m6A水平增加。由于人卵母细胞受伦理等的限制，缺少直接对人卵母细胞进行FTO基因干预的研究。尽管如此，由于颗粒细胞承担着卵母细胞物质运输和信号传递等重要作用，我们可以推测，当颗粒细胞的增殖和凋亡改变时，必然会影响到卵母细胞的正常生长。FTO与卵母细胞的直接联系还需要更多后续研究来揭示。

2.ALKBH5：ALKBH5和FTO同属于ALKB家族，然而ALKBH5对卵巢颗粒细胞的影响并未表现出与FTO类似的现象[25]。有趣的是，尽管ALKBH5在卵巢中的作用尚不明确，与卵母细胞发生关系的研究更是少见，但是却在小鼠睾丸中高表达，ALKBH5缺失会导致小鼠精子成熟停滞，最终导致不育[27]。这也体现了同一家族不同成员之间对作用细胞种类的特异性。

三、m6A甲基结合蛋白对卵母细胞发生的影响

m6A的甲基结合蛋白优先与mRNA上的m6A结合，通过调控mRNA剪接和输出以诱导其下游基因。

1.YTHDF1/2/3：通过调控卵母细胞成熟过程中的基因转录，保证卵母细胞具备维持早期合子正常发育的能力。在卵泡发育的各个阶段，YTHDF2在卵母细胞和颗粒细胞中均有表达[28]。卵母细胞特异性缺失Ythdf2的雌性小鼠(Ythdf2mCKO)能够正常排卵并形成黄体，当使用孕马血清(PMSG)和HCG促排卵后也可产生与野生型数量相当的MII卵母细胞，然而，Ythdf2mCKO小鼠受精后正常的两细胞期胚胎数量减少且胚胎内还会出现微核或去核等胞质分裂缺陷的情况[28]。相似的情况在Zhao等[29]对斑马鱼的研究中也有报道，缺失Ythdf2的斑马鱼会严重损害其胚胎的正常发育。深入分析Ythdf2mCKO小鼠发现，MII期卵母细胞转录组内的基因表达失调，而GV期卵母细胞转录组内的基因表达却接近正常，说明在卵母细胞成熟过程中YTHDF2调控正常的基因转录，从而保证卵母细胞维持早期合子的正常发育[28]。Ivanova等[28]研究发现，缺失Ythdf2的小鼠在减数分裂和卵母细胞成熟过程中，导致YTHDF2调控的基因表达上调，从而扰乱了卵母细胞的正常成熟过程。

YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3协同合作，通过影响m6A修饰mRNAs的翻译和衰变，促进细胞质中mRNAs的代谢过程[28，30]，调节卵母细胞的m6A水平。

2.YTHDC1/2：YTHDC1/2通过阻止卵母细胞中出现选择性聚腺苷酸化来维持pre-mRNA 3’UTR长度的稳定，从而利于卵母细胞成熟。YTHDC1定位于含有活性转录位点的核斑，最初称为YT521-B。YTHDC1为减数分裂染色质相关蛋白，可影响RNA核输出等功能[31]。从GV期到MII期的小鼠卵母细胞中YTHDC1蛋白水平逐渐增加，表明YTHDC1由休眠的母体mRNA编码，在卵母细胞成熟过程中被招募[32]。当雌性小鼠Ythdc1基因失活，卵巢上表现为次级卵泡或窦状卵泡缺乏，卵母细胞发育阻滞在初级卵泡阶段[32]。Ythdc1缺失导致卵母细胞细胞核中原本与YTHDC1结合的pre-mRNA转录产物在加工过程中出现大量选择性剪接缺陷，卵母细胞中选择性聚腺苷酸化增加，pre-mRNA的3’UTR长度改变[32]。pre-mRNA 3’UTR包含许多microRNA及RNA结合蛋白的靶点，3’UTR延长或缩短将对翻译效率、转录稳定性和亚细胞转录本定位产生影响[33-34]。因此，卵母细胞中YTHDC1对于防止选择性聚腺苷酸化、维持pre-mRNA 3’UTR长度的稳定、达到精确调节卵母细胞成熟起着重要作用。

YTHDC2主要在哺乳动物的睾丸组织中高度特异性表达，参与精子的减数分裂，对精子发生起着重要调控作用[35]。目前，尚不清楚YTHDC2与卵母细胞发育的关系。

3.IGF2BP3：通过调节与染色体配对和同源重组相关分子的表达进而影响初级卵母细胞的发育。Igf2bp3在鱼类和哺乳动物中高度保守。研究发现，青鳉鱼卵巢内IGF2BP3高表达，当青鳉鱼卵巢缺失性腺体细胞衍生因子(Gsdf)时，卵巢中IGF2BP3的表达显著增加，表现为卵巢内过量的初级卵母细胞不规则积累、呈现囊性[36]。Vg1RBP/Vera是Igf2bp3的同源基因。据报道，Vg1RBP/Vera对非洲爪蟾卵母细胞发生中的mRNA定位至关重要[37]。Igf2bp3在青鳉鱼和非洲爪蟾中的表达模式类似，表明Igf2bp3也可能在卵母细胞mRNA的准确定位上起重要作用，但具体的调控方式目前尚不清楚。

综上所述，无论是m6A甲基转移酶、去甲基化酶还是甲基结合蛋白都可能对卵母细胞的生长、成熟有影响。在卵母细胞减数分裂过程中，卵母细胞mRNA甲基化状态调节了细胞翻译和细胞分裂过程[19]。在此期间，甲基转移酶、去甲基化酶及结合蛋白作为不可分割的整体共同调控了卵母细胞内mRNA的甲基化状态。

四、展望

异常的m6A修饰水平可导致RNA功能失调，影响基础生物学过程，进而引发癌症、卵母细胞发育障碍和代谢性疾病等[6，38]。女性在自然衰老或病理衰老后，卵巢内m6A甲基化水平增高[25-26，39]。因此，深入研究m6A甲基化酶、去甲基化酶和结合蛋白各相关分子与卵母细胞生长、成熟的关系，有可能寻找到临床干预POI和治疗卵巢早衰(POF)的分子靶标，进而达到改善生育能力、提高生活质量的目的。