表没食子儿茶素没食子酸酯对雌性生殖系统作用的研究进展

郭燕洁，方兰兰，孙莹璞

(郑州大学第一附属医院生殖与遗传专科医院，郑州 450052)

绿茶是一种未经发酵的茶，其生物活性有效成分主要为多酚类化合物——茶多酚[1]，绿茶中酚类物质中80%为类黄酮化合物，而类黄酮类物主要成分为儿茶素。四种主要的茶多酚被命名为儿茶素，包括表儿茶素没食子酸酯(epicatechin-3-gallate，ECG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、表儿茶素(epicatechin，EC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)等几种单体[2]。近年，绿茶有效成分的益处被广泛地研究。EGCG是生物活性最高的一类儿茶素，在绿茶中含量最高。EGCG具有抗病毒、抗氧化、促凋亡及代谢、调节内分泌和血管生成活性等特性。由于这些功能，EGCG可以减少心血管疾病和炎症疾病的发病率、减轻糖尿病、降低血胆固醇水平以及减轻癌症等疾病的发生发展[3-5]。EGCG作为无毒的天然产物，在生殖领域也被广泛地研究。研究发现其在提高配子抗氧化能力、改善胚胎质量、调控类固醇激素合成以及在抗生殖系统肿瘤等相关疾病中都有一定作用[6-8]。本文就儿茶素EGCG的生物学特性以及其对雌性生殖健康的研究进展进行了总结，以期加深对于EGCG在生殖系统中的作用的认识与理解。

一、EGCG分子特性及主要功能

(一)EGCG的分子特性

儿茶素EGCG化学分子式为C22H18O11，其分子量为458.4。经典的EGCG提取分离及单体制备工艺有膜分离法、树脂法、金属离子沉淀法、超声波辅助萃取法等。制备儿茶素中EGCG单体时，需要进一步经过高效液相色谱法或柱色谱法纯化[9]。EGCG结构中具有6个邻酚羟基和一对间羟基基团，众多的酚羟基使得EGCG具有许多优于其他儿茶素的性质[10]。4种包括EGCG在内的主要的儿茶素及结构如图1所示。目前已知的 EGCG 受体为67 KDa的层粘连蛋白受体(67 KDa laminin receptor，67LR)，被发现只能特异性结合EGCG，而其他的儿茶素如EC、ECG、EGC则不能结合此受体[11]。在生殖系统中，EGCG受体的67LR已经在人卵巢癌细胞系OVCAR-3、人乳突状卵巢腺癌细胞Caov-3、卵巢腺癌细胞系SKOV3等细胞中证实其存在[12]。

A：EGC；B：EC；C：ECG；D：EGCG。抗氧化和去除晚期糖基化终末产物的活性酚羟基苯环用蓝色高亮显示，4种化合物差异的烃基基团用红色显示图1 绿茶中的4种儿茶素结构式

(二)EGCG的生物活性作用

现有研究表明，茶多酚EGCG具有降血压、降血糖、降血脂、预防心脑血管疾病、抑制肿瘤发生发展等多种药理活性[13]，其抗氧化和抗肿瘤作用在人体被广泛研究。

1.抗氧化功效：绿茶被认为是抗氧化剂的饮食来源，绿茶中EGCG 抗氧化的能力较为突出，使其成为明星生物活性物质。EGCG可以通过减少活性氧(reactive oxygen species，ROS)、清除自由基实现抗氧化的功效[14]。绿茶中也包含很多其他物质，例如维生素C、类胡萝卜素和维生素E、矿物质以及普遍的植物化学成分，这些成分可能会提高EGCG的抗氧化性[15]。

EGCG有高于维生素C的清除自由基、抗氧化作用[16]，在体内充当自由基的清道夫，可以保护生殖细胞对抗氧化应激(oxidative stress，OS)[17]。其抗氧化功效主要通过以下4个机制发挥作用：(1)螯合金属离子：EGCG具有邻苯二酚结构，因此具有很强的金属离子螯合能力，能结合Haber-Weiss和Fenton反应中的铁离子和游离铁，从而降低其含量[18]；(2)结合自由基：羟自由基和超氧阴离子自由基可引起细胞内脂质过氧化反应，进而引起细胞损伤。而EGCG具有这两种自由基的强结合力，通过扫除自由基而降低细胞的氧化应激[18]；(3)调节转录因子或酶活性：EGCG在体内可以通过影响转录因子或酶的活性来间接发挥抗氧化作用，如通过氧化还原调节的转录因子调控以及增强谷胱甘肽-S-转移酶的活性等[19]；(4)调控酶活性/清除氧化中间产物：EGCG在体内还能通过调控酶的活性来发挥抗氧化作用，如基于丝裂原激活的蛋白激酶的细胞周期的调节[20]。在细胞内，EGCG 具有清除氧化中间产物的能力，参与到包括AKT/mTOR通路、MRLC 通路、RANK通路、TLR2/3通路、ERK1/2通路等众多分子通路中[21-22]。

2.抗肿瘤作用：EGCG 还具有广泛的抗肿瘤作用，被证实在卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、胃癌等肿瘤中，可以抑制细胞的生长、增殖，并减少迁移和侵袭，提高体内抗肿瘤的免疫力，从而抑制肿瘤的发生发展[23]。而在众多肿瘤模型研究中，应用5 μmol/L至200 μmol/L的EGCG处理肿瘤细胞或组织，发现往往是较低浓度的EGCG处理可以起到抗肿瘤效果[23]。乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，体外实验证明EGCG可以阻碍细胞周期、抑制细胞增殖和分化；能够通过调控VEGF的表达抑制血管生成，诱导细胞凋亡；还可以抑制有害物的致癌发生率，降低已形成肿瘤的大小、数目及肿瘤细胞的侵袭和转移[24]。

(三)EGCG的代谢

关于绿茶保健功能的研究主要是在体外实验，对其代谢特性的研究主要集中在体外的生物活性测定。目前对于EGCG体内生物转化的研究尚浅，深入探讨EGCG的生物利用度有助于明确其作用效果和机制。目前的研究结果显示，EGCG在pH 7.4的条件下进行体外转化时半衰期为0.56 h。加入金属螯合剂和二乙基三胺五乙酸能够延长其半衰期，三价铁离子能加速其降解，这是因为 EGCG在溶液中可以结合金属离子[25]。EGCG具有生物稳定性低、生物转化率高、代谢率不稳定的特性。现有研究表明胃部和肠道的极端条件以及相关消化酶会导致EGCG发生降解或者聚合反应。儿茶素主要通过被动扩散(包括细胞旁扩散和跨细胞扩散)通过肠上皮转运，而目前小肠上皮细胞表面没有发现可以转运进入细胞的特异性受体[26]，这是EGCG吸收率低的主要原因；部分吸收的儿茶素的主动外排也降低了血浆儿茶素浓度。

二、EGCG在生殖系统的作用和功能

1.EGCG与卵母细胞成熟：导致不孕的因素众多，其中营养缺乏、农药和工业化学品主动和被动摄取、吸烟、过度饮酒等，可以通过增加氧化应激的方式破坏卵子的质量[27]。放射线或尿路感染等因素也会影响女性生育能力，当ROS的产生超过人体的抗氧化能力时，就会发生氧化应激。此时氧化应激会引发脂质氧化，从而破坏膜的完整性并增加其渗透性，造成细胞中酶的失活，导致DNA结构损伤和细胞凋亡，从而抑制卵母细胞的发生与成熟[28]。卵母细胞成功受精的关键在于卵母细胞的成熟，卵母细胞不成熟最终会导致生育力下降。探究EGCG分子在女性生殖系统的抗氧化作用调控机制，有助于改善卵子抗氧化能力，提高卵母细胞成熟率，为提高女性生育相关疾病提供新的诊疗策略。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是哺乳动物中含巯基的多肽成分，有保护细胞抵抗氧化性损伤的功能，也是卵母细胞活性和发育潜能的潜在标记物。有研究发现加入更多ROS后，卵母细胞中谷胱甘肽含量减少，同时卵母细胞成熟受到抑制[29]。Wang等[30]在牛卵母细胞从GV期至MⅡ期体外培养过程中加入不同浓度EGCG进行处理，发现加入15～20 μmol/L EGCG能够明显提高卵母细胞中GSH含量，从而降低细胞内ROS的积累，进而提高受精后胚胎的囊胚形成率。然而过低(<10 μmol/L)或过高浓度(>25 μmol/L)EGCG处理体外成熟培养(IVM)的卵母细胞时，卵母细胞GSH含量虽高于对照组，但无显著差异，对卵母细胞成熟无显著改善作用。这说明只有适当浓度EGCG可以促进牛卵母细胞体外成熟与卵泡发育。

外源应激会通过增加氧化应激从而影响卵母细胞的功能，如高热会破坏卵母细胞的完整性，而一定浓度的EGCG可以抵抗热应激，从而促进卵母细胞的成熟。在雌性小鼠体内注射EGCG(100 mg/kg)后，分别暴露在22℃和40℃的环境中，可以有效改善体外成熟卵母细胞的发育，由优质卵母细胞发育而来的胚胎质量也有所提高[31]。

此外，农药成分甲基对硫磷(methyl parathion，MP)的残留会破坏卵子质量，其方式是通过增加氧化应激降低核成熟率，造成内质网、线粒体组分改变和纺锤体分布异常，进而引起细胞质成分紊乱。研究表明，Swiss albino鼠卵母细胞体外成熟培养过程中加入0.25 μmol/L EGCG，可以通过缓解卵母细胞氧化应激和内质网应激水平，提高核成熟率、减轻胞质成分紊乱，从而减轻MP(100 μg/ml)对卵母细胞的毒性作用，改善MP所致的卵子成熟障碍[32]。

以上研究表明，EGCG可提高卵子生理和病理状态下对抗氧化应激的能力，有效降低外界氧化应激与内质网应激损伤的程度。

综上所述，儿茶素EGCG对卵母细胞的发育和成熟调控有物种差异性和浓度差异性，EGCG在哺乳动物间具有提高卵母细胞抗氧化应激能力与促进成熟的潜力，可以更进一步提高受精率与胚胎发育能力。

2.EGCG与胚胎发育：胚胎在体外培养时，不受母源抗氧化活性物质的保护，其抗氧化活性相较于在体内更低，在此环境中产生的氧自由基可能抑制胚胎的成熟，需要增加抗氧化剂以提高体外培养的胚胎质量[33]。绿茶中的儿茶素EGCG有提高哺乳动物的配子质量和体外受精成功率的潜力[34]。Ahmed等[35]的研究表明EGCG可作为胚胎冻存液中提高抗氧化应激能力的抗氧化剂。

近期有研究报道了EGCG对小鼠受精情况和胚胎发育的影响。在体外培养卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complex，COCs)的模型中，添加20 μmol/L的EGCG时发现小鼠成熟卵母细胞COCs内GSH浓度显著提高，并提高了卵母细胞受精率和胚胎发育率[36]。另有研究在小鼠裸卵细胞培养基中加入不同浓度的EGCG，测量GSH浓度和卵母细胞成熟率、受精率和二细胞发育率。结果显示，随着儿茶素EGCG浓度的增加，卵母细胞成熟率没有明显变化，但可以提高胚胎受精率和二细胞的发育率[37]。这是因为在裸卵培养过程中，由于缺乏颗粒细胞，EGCG不能通过颗粒细胞增加细胞内GSH浓度，故经过EGCG处理后对胚胎的发育影响不大。

此外，Spinaci等[38]研究表明，EGCG对胚胎质量的影响具有浓度差异性。在IVM和IVF过程中，加入 0、5、15、20 μg/ml的EGCG对猪胚胎的发育能力没有明显影响，但25 μg/ml剂量的EGCG对猪孤雌生殖胚胎的体外发育有抑制作用，其发育到囊胚的数量有所下降。Li等[39]在IVM培养基中加入不同浓度 EGCG，在加入10 μg/ml EGCG 后，体外激活的猪胚胎中ROS水平较其他组显著降低，而使用50 μg/ml EGCG处理后培养出的囊胚，每个克隆囊胚的细胞总数低于其他各对照组(P<0.05)，表明体外培养中过量EGCG可能对胚胎发育造成损伤，同时体细胞核移植胚胎的质量下降，这显示了EGCG对猪克隆胚胎的体外发育可能有负效应。

因此，儿茶素EGCG可以保护哺乳动物胚胎发育过程中免于氧化作用的影响，提高胚胎受精率和胚胎发育率。但是过量的EGCG可能会对胚胎的发育有促进细胞凋亡的作用，引起负性毒性作用，从而影响胚胎发育。

3.EGCG参与类固醇激素合成及卵泡发育：类固醇激素在卵泡生长发育的过程中起着不可或缺的作用，在女性不孕症的众多发病原因中，类固醇甾体激素生成障碍及其引起的卵泡发育障碍是女性不孕的主要原因[40-41]。卵泡发育是在颗粒细胞与卵母细胞的相互作用下进行的，卵泡的正常发育离不开颗粒细胞的分泌作用，而激素分泌异常会造成卵泡发育停滞或卵泡过度消耗，同时也会进一步加剧机体内分泌紊乱。性激素中雌二醇、孕酮和睾酮均属于类固醇甾体激素。研究发现儿茶素EGCG可以调控类固醇激素生成和卵泡的发育，研究EGCG对类固醇激素的调控对女性生殖健康具有重要意义。

有研究讨论了儿茶素EGCG处理猪原代颗粒细胞对类固醇激素生成的影响。使用不同浓度EGCG处理猪原代颗粒细胞48 h后，检测培养基中孕酮和睾酮的浓度，发现10 μg/ml EGCG处理颗粒细胞后，产生的孕酮较对照组升高2倍左右，而在较低或更高浓度EGCG处理后则没有显著差异；同时，在1 μg/ml EGCG处理颗粒细胞后，其睾酮输出总量升高[42]。另有研究发现，经过EGCG处理48 h的猪卵母细胞，检测到卵丘细胞中胰岛素样生长因子和孕酮水平降低[37]。

此外，EGCG具有促进雌性家兔卵巢细胞凋亡和调控类固醇激素生成的作用。在雌性家兔模型的体外实验中，分别使用不同浓度EGCG处理家兔的卵巢组织，发现在低浓度EGCG(1 μg/ml)处理时，孕酮和睾酮的浓度均升高，而较高浓度EGCG(10 μg/ml、100 μg/ml)处理家兔卵巢组织时，孕酮和睾酮的浓度则会降低，而细胞的凋亡均增多；体内实验证实，用常规和添加两种含量绿茶的饲料喂养家兔到成年后，较高浓度绿茶饲养的家兔受孕率降低，且成熟卵泡排卵受到抑制，证实EGCG可以降低家兔的卵巢功能和繁殖力[43]。

类固醇激素雄烯二酮是雌酮和睾酮的前体物质，在绝经后中国女性的一项研究中，每周各天均饮用绿茶的女性，其血浆中雌酮、雌二醇和雄烯二酮激素均高于对照组女性(每周饮用绿茶小于1次)[44]。

以上研究结果表明，EGCG对类固醇激素的生成有调控作用，但其作用有浓度依赖性，不同浓度的作用效果不相一致。

三、临床转化与挑战

为了提高儿茶素尤其是EGCG的生物活性，一些技术被开发出来，如基于纳米结构的药物传递系统、分子修饰和儿茶素的联合给药等[45]。将EGCG包裹在蛋白质、碳水化合物和脂质基纳米颗粒上可以提高EGCG的稳定性和胞膜渗透性，并使其得到持续释放，从而提高儿茶素的生物利用度。应用分子修饰的方法，如合成过氧乙酰化可保护羟基免受氧化降解，直至其被细胞内的酯酶脱乙酰化[46]，减少EGCG的生物转化和流失。此外，将EGCG适当与其他药物或生物活性物质共同施用，通过EGCG与所选药物的相互作用产生协同效应，可以提高吸收率和抑制细胞转运体的外排作用[47]。

研究儿茶素EGCG的生物利用度还有很大的发展空间。目前研究显示，EGCG作用的疾病靶向性和多分子靶向性有望得到改善，从而找到更有效、更稳定和特异性的EGCG活性制剂[47-48]。在改善卵子和胚胎质量、降低氧化应激方面，或可应用持续低剂量EGCG方案进行治疗；在生殖系统肿瘤的治疗中，有希望采用EGCG的靶向给药和快速释放高剂量方法治疗疾病。目前文献中的证据尚不支持EGCG作为临床试验药物在女性不孕症中的应用，这些改进技术的有效性需要进一步的临床验证。

四、结语

多个研究结显果示，EGCG在雌性生殖力的保护和提高生殖力方面具有良好的应用前景。儿茶素EGCG是天然的无毒性氧化应激清除剂，可以调控卵母细胞发育的各个阶段，并参与胚胎发育、激素生成的调控。不同剂量的EGCG有不同的作用效果，在针对不同生殖系统功能的治疗时需要选用最佳剂量。有研究证实，一杯200 ml的普通绿茶中大约含有140 mg的EGCG，每日适当饮茶即可以补充一定量的EGCG[49]。在日常饮食中适当地摄入EGCG，有可能提高女性卵母细胞成熟率，对生育力保护具有一定的积极意义。

综上所述，EGCG为体外生殖细胞和胚胎培养等临床应用提供了新方向，对女性生殖系统功能的改善具有良好的应用价值。