胚胎植入前非整倍体检测：囊胚形态学评分有指导作用吗？

饶群，白剑，胡丹，杨殊琳

(华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖医学中心，武汉 430000)

生殖医学领域往往采用形态学评分来决定胚胎移植顺序。目前应用比较广泛的囊胚形态学评分标准是1999年Gardner评分标准[1-3]，其使用囊胚腔扩张程度、内细胞团(ICM)外观和滋养外胚层细胞(TE)的外观来评价囊胚质量。

随着胚胎植入前非整倍体检测(Preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)的开展，囊胚形态学评分与胚胎整倍性的关系越来越受到关注。一些研究将囊胚形态学的整体评级作为独立指标，研究其与胚胎整倍性的关系[4-5]，还有研究分别将ICM分级、TE分级和囊胚腔的扩张程度作为3个独立指标探讨其与胚胎整倍性的关系[6-7]。此外，囊胚发育天数与扩张程度共同体现了囊胚的发育速度，有些学者认为囊胚腔扩张程度变化快，不可作为可靠的评价指标[8]；而另一些学者认为，囊胚发育速度是其整倍体率的独立影响因素[9]。因此，如何选择囊胚形态学评价指标探讨形态学评分与胚胎整倍性的关系仍然存在争议。

女性卵母细胞整倍体率和活产率随年龄的增长而下降[6，10-11]。有研究提示在PGT-A周期中，整倍体胚胎的形态学评分可预测继续妊娠率[12-13]，且胚胎形态学评分越高其移植后活产率越高[3，14-19]。也有研究表明，胚胎整倍性与活产密切相关，超过50%的整倍体胚胎可获得活产，且这一结论与女方年龄和囊胚形态学评分无关[4-5，20-22]。由于胚胎形态学评分、胚胎整倍性和临床妊娠结局之间的关系仍存在争议，如何最大限度的提高患者收益、缩短获得妊娠的时间是生殖领域医生面对的挑战。本研究回顾性分析在本中心进行活检的囊胚形态学评分和相关临床资料，探讨囊胚形态学评分在PGT-A周期中的指导作用。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2019年1～12月在本中心行PGT-A的177个取卵周期(共732枚活检胚胎)的临床资料。本中心进行PGT-A的适应症(符合其一即可)：(1)不明原因反复妊娠丢失(RPL≥2次)；(2)高龄(年龄≥38岁)；(3)流产物检测出染色体非整倍体；(4)反复移植失败(RIF)；(5)夫妻一方为染色体数目异常。

纳入标准：(1)所有患者卵巢刺激均使用激动剂降调节方案(卵泡期长方案或黄体期长方案)或拮抗剂方案；(2)所有胚胎都在囊胚期进行活检；(3)均采用二代测序(NGS)进行非整倍体筛查检测；(4)所有卵母细胞均来自患者本人，无供卵周期。

排除标准：(1)因活检细胞量不足或单细胞扩增失败导致检测失败的胚胎；(2)因高龄、RPL行PGT-A的胚胎；(3)重复活检的胚胎；(4)嵌合体胚胎；(5)因夫妻一方染色体异常导致的非整倍体胚胎；(6)临床数据不全(如缺失年龄或随访结果)的胚胎。

按照纳入和排除标准，最终本研究共纳入474枚囊胚，其中因流产物检测出染色体非整倍体行PGT-A的胚胎占比51.9%(246/474)，因RIF行PGT-A的胚胎占比1.1%(5/474)，因夫妻一方染色体数目异常行PGT-A的胚胎占比47.0%(223/474)。

二、诊疗回顾

具有PGT-A适应症的患者通过控制性促排卵后接受取卵手术，使用卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术进行体外受精，之后在体外培养至第5天(D5)或D6形成囊胚，利用激光法进行囊胚活检，随后进行NGS检测。

1.控制性促排卵：激动剂方案使用曲普瑞林(Triptorelin，辉凌公司，瑞士)进行降调节；拮抗剂方案使用醋酸西曲瑞克(Cetrorelix Aacetate Ppowder，百特肿瘤制药有限公司，德国)抑制LH峰。予以重组人卵泡刺激素(rFSH，默克雪兰诺公司，瑞士)和/或人尿促性素(HMG，珠海丽珠制药公司)进行卵巢刺激。B超监测卵泡发育，当超声监测有2个以上优势卵泡直径≥18 mm时，予人绒毛膜促性腺激素(HCG，沈阳光大制药有限公司)肌内注射10 000 U，36～38 h后超声引导下卵泡穿刺取卵。

2.体外受精与活检：所有卵母细胞均行ICSI。胚胎培养采用G系列序贯培养系统。受精后5～6 d，对质量优于3BC的囊胚进行活检。利用激光法于囊胚ICM对侧的滋养外胚层分离出3～8个细胞进行检测。冷冻活检后的囊胚，等待检测结果。

3.囊胚形态学评分：本中心采用Gardner提出的囊胚形态学评分方法[1-3]进行评价，囊胚腔扩张程度3期以上、ICM和TE总体评分在AA/AB/BA的为优质囊胚，BB为一般囊胚，余下等级为较差囊胚[8]。评级低于3BC囊胚丢弃，不予活检。

4.PGT-A检测：文库制备使用植入前遗传学筛查试剂盒(Pre-implantation Genetics Screening Library Prep Kit，亿康基因，中国)进行。用基于多次退火环状循环扩增技术的基因扩增和文库构建法(MALBAC-Lab)进行全基因组扩增和文库构建。测序平台为MiniSeq，测序结果由亿康基因公司行质量控制。

5.冷冻囊胚复苏移植：均采用激素替代周期进行内膜准备，行冻融单囊胚移植。囊胚复苏使用玻璃化解冻试剂盒(Kitazato Biopharma Co.Ltd，日本)。

6.随访：移植后14 d测血HCG，阳性者移植后28 d行B超检查，见宫内孕囊及胎心搏动者确定为临床妊娠。所有临床妊娠患者随访至妊娠终止或活产。

三、研究分组

本研究按照两个层次进行分析比较。首先对在本中心行PGT-A的所有732枚囊胚按照纳入标准和排除标准进行筛选，共有474枚囊胚纳入研究，按照活检时间不同分为D5组(204枚)和D6组(270枚)(具体筛选及胚胎评分情况见图1)，探讨囊胚评

图1 所有活检囊胚的筛选流程

级与整倍体率及活产率的关系。考虑到本研究中大部分囊胚ICM和TE评分为BB级，故将纳入研究的244枚BB级囊胚按照不同囊胚扩张程度分为<4期、4期和>4期3组(具体筛选及胚胎评分情况见图2)，探讨D5或D6活检的囊胚扩张程度对整倍体率和活产率的影响。

图2 BB级活检囊胚的筛选流程

四、统计学分析

采用GraphPad Prism 9统计软件系统进行数据分析。计量资料的组间均数比较采用t检验或ANOVA分析，组间率的比较采用Chi-square检验，不满足Chi-square检验的采用Fisher确切概率法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、纳入囊胚的患者基线资料比较

474枚囊胚中D5活检囊胚204枚，其中优质囊胚19枚，一般囊胚129枚，较差囊胚56枚；D6活检囊胚270枚，其中优质囊胚10枚，一般囊胚115枚，较差囊胚145枚。各亚组间女方平均年龄、基础FSH、抗苗勒管激素(AMH)、体质量指数(BMI)值比较均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 纳入囊胚不同活检时间和评级亚组的基线资料比较(-±s)

通过PGT-A获得的233枚整倍体胚胎中，移植了126枚，根据移植的囊胚不同分为D5移植组(移植D5活检囊胚，n=61)和D6移植组(移植D6活检囊胚，n=65)。D5移植组中移植优质囊胚8枚，一般囊胚40枚，较差囊胚13枚；D6移植组中移植优质囊胚5枚，一般囊胚32枚，较差囊胚28枚。各亚组间女方平均年龄、基础FSH、AMH、BMI值比较均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 移植不同时间整倍体囊胚各亚组基线资料比较(-±s)

二、纳入囊胚各组整倍体率和移植临床结局比较

D5组活检囊胚的整倍体率比较，一般囊胚显著高于较差囊胚(P=0.025，OR=2.173，95%CI：1.160-4.043)，其余各组比较整倍体率均无显著性差异(P>0.05)。D6组活检囊胚的整倍体率比较，一般囊胚亦显著高于较差囊胚(P=0.005，OR=2.094，95%CI：1.280-3.488)，其余各组比较整倍体率均无显著性差异(P>0.05)。D5组和D6组两组间优质囊胚、一般囊胚、较差囊胚的整倍体率比较均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

PGT-A检测后获得的整倍体囊胚中，移植D5优质囊胚、一般囊胚、较差囊胚的活产率无显著性差异(P>0.05)；移植D6优质囊胚、一般囊胚、较差囊胚的活产率无显著性差异(P>0.05)。两组间比较，移植D5、D6不同囊胚评级的活产率亦无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 纳入囊胚各亚组整倍体率和活产率比较(%)

三、BB级囊胚各组患者基线资料比较

244枚BB级囊胚中D5活检囊胚(D5组)129枚，其中扩张程度<4期囊胚35枚，4期囊胚92枚，>4期囊胚2枚；D6活检囊胚(D6组)115枚，扩张程度<4期囊胚12枚，4期囊胚82枚，>4期囊胚21枚。各亚组间女方平均年龄、基础FSH、AMH、BMI值比较均无统计学差异(P>0.05)(表4)。通过PGT-A获得的整倍体胚胎中，移植了72枚，其中D5移植组40枚(扩张程度<4期的9枚，4期的31枚，>4期的0枚)；D6移植组32枚(扩张程度<4期的2枚，4期的22枚，>4期的8枚)。各亚组间女方平均年龄、基础FSH、AMH、BMI值比较均无统计学差异(P>0.05)(表5)。

表4 BB级囊胚不同活检时间和扩张程度亚组的基线资料比较(-±s)

表5 移植不同时间BB级整倍体囊胚各亚组基线资料比较(-±s)

四、BB级囊胚各组整倍体率和移植临床结局比较

BB级囊胚中D5组活检囊胚的整倍体率比较，扩张程度<4期、4期、>4期各组整倍体率均无统计学差异(P>0.05)；D6组活检囊胚的整倍体率比较，扩张程度<4期组显著高于4期组(P=0.026，OR=0.203，95%CI：0.057-0.711)，余各组囊胚整倍体率差异无统计学意义(P>0.05)。D5组和D6组两组间扩张程度<4期、4期、>4期组的整倍体率比较均无显著性差异(P>0.05)(表6)。

PGT-A检测后获得的BB级整倍体囊胚中，移植D5扩张程度<4期、4期、>4期囊胚的活产率无显著性差异(P>0.05)；移植D6扩张程度<4期、4期、>4期囊胚的活产率无显著性差异(P>0.05)。两组间比较，移植D5、D6不同扩张程度的囊胚活产率亦无显著性差异(P>0.05)(表6)。

表6 BB级活检囊胚各亚组整倍体率和活产率比较(%)

讨 论

随着NGS技术的发展，PGT-A技术被临床广泛运用。但是，其有效性和安全性尚存在争议。为了更好地提高患者的囊胚利用率、节省患者的治疗费用、缩短其获得妊娠的时间，移植囊胚的选择就显得尤为重要。已有研究表明，囊胚形态学与整倍体率相关[4-7，23]，其整倍体率主要受促排卵方案和培养体系影响，与囊胚培养天数无关[24]。而另一些研究发现，D5活检的囊胚其整倍体率和活产率显著高于D6活检的囊胚[25-26]。国内研究证明，无论是新鲜周期还是冻融周期的单囊胚移植，囊胚扩张程度可预测活产，而ICM及TE分级则与活产无关[27]。也有文献指出扩张程度4期以上的囊胚有较高的着床率[28]。但基于现有研究结果，囊胚形态学评分、胚胎整倍体率和临床结局之间的关系仍然存在争议。

本研究纳入的研究对象均为冻融移植周期单囊胚移植患者，且内膜准备方案均为激素替代周期，以排除不同的卵巢刺激方案对内膜容受性的影响以及移植胚胎数目对临床结局的影响，同时还排除了高龄、染色体异常、复发性流产、RIF等因素，以尽量减少临床结局的混杂因素。本研究将ICM、TE评分以及囊胚扩张程度作为独立因素分别讨论，评价囊胚形态学评分在PGT-A周期中的指导作用。本研究结果显示，整体纳入研究的囊胚中ICM和TE评分较差囊胚的非整倍体率显著升高，而囊胚发育天数对其整倍体率并无显著预测作用。对于同级别的整倍体胚胎，虽然最终结果没有统计学差异，但发育速度快的(D5活检)囊胚其活产率略高于发育较慢胚胎(D6活检)，原因可能是D6囊胚较D5囊胚发育速度延迟，且体外培养时间较长，DNA损伤的可能性增加，导致发育潜能较差[29]。冻融周期中D5囊胚在玻璃化冷冻及复苏过程中，可能更能耐受冷冻损伤，有较高的发育潜能[30]。BB级囊胚统计结果显示D6活检评级为BB级的囊胚扩张程度<4期时，其非整倍体率较4期组更高。虽然D5活检的整倍体胚胎移植活产率有高于D6的趋势，但差异尚无统计学意义。因此，我们认为，PGT-A可优先用于检测发育速度较慢(D6囊胚)、扩张程度<4期的较差囊胚(ICM和TE评级低于BB级)。在移植时，囊胚形态学评分与临床结局无关，建议优先选择发育速度较快(D5活检)的整倍体胚胎进行移植。但本研究也存在一定的局限性，首先，纳入研究数目较少且纳入的囊胚多为4BB级别，因此其分析结果可能存在一定偏倚，需进一步扩大样本量后进行研究；其次，囊胚形态学评分具有一定主观性，可能造成偏倚。

综上所述，本研究结果再次证实了囊胚形态学评分越差，其非整倍体发生率越高。在通过PGT-A检测后，D5活检获得的整倍体胚胎移植时具有更高的活产率。因此，建议临床工作中，对于发育速度较慢(D6囊胚)、扩张程度<4期的较差囊胚(ICM和TE评级低于BB级)进行PGT-A检测更具临床意义；经PGT-A筛查获得的整倍体胚胎，胚胎形态学评分在预测活产率中无明显作用，建议优先选择发育速度较快(D5活检)的整倍体胚胎进行移植。