三种泽泻提取物的抗氧化活性及23-乙酰泽泻醇B含量的研究

毕丽伟，庞海月，陈煜沛,，黄立森,，吴黉坦,，张亚楠，王贵弘,*

(1.厦门医学院药学系，福建 厦门 361023；2.厦门医学院公共卫生与医学技术系，福建 厦门 361023；3.天然化妆品福建省高校工程研究中心，福建 厦门 361023；4.厦门市中药生物工程重点实验室，福建 厦门 361023)

泽泻(AlismaplantagoaquaticaLinn.)是喜温耐湿的多年生沼生植物，干燥块茎入药，主治热淋涩痛、疲饮眩晕、水肿胀满、小便不利和遗精等症，收录于《中华人民共和国药典》2015年版中[1]。泽泻的主要化学成分为三萜类、二萜类、倍半萜类，还含有氨基酸、蛋白质、生物碱、脂肪酸、糖类、植物甾醇等少量化学成分[2-5]。研究表明，泽泻具有利尿、抗肾结石、免疫调节、降血脂、降血糖、抗脂肪肝等多种生物活性[6-7]；另有报道，泽泻具有较强的毒性，尤其是肾毒性[8]。《中华人民共和国药典》2015年版将23-乙酰泽泻醇B(图1)作为泽泻药材的标准物质[7,8-11]。作者采用总抗氧化能力、羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力评价泽泻水提取物、65%乙醇提取物和95%乙醇提取物的抗氧化活性，并采用HPLC法分析3种提取物中主成分23-乙酰泽泻醇B的含量差异，拟为泽泻的开发利用提供帮助。

图1 23-乙酰泽泻醇B的化学结构式Fig.1 Chemical structure of 23-acetyl alisol B

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

泽泻(福建产)饮片，北京同仁堂有限责任公司。

乙醇、乙腈(色谱级)，西陇化工股份有限公司；23-乙酰泽泻醇B标准品，成都瑞芬思生物科技有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒、羟基自由基清除能力检测试剂盒、超氧阴离子自由基清除能力检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津；R-2000型旋转蒸发仪，Panchum公司；Sunrise型多功能酶标仪，Tecan公司；LE2002E型电子天平，Mettler Toledo公司；冷冻干燥机，Labconco公司。

1.2 泽泻提取物的制备

将泽泻饮片干燥，称取适量按料液比1∶10 (g∶mL)分别加入水、65%乙醇、95%乙醇加热回流萃取1 h，过滤，得到第1次滤液；滤渣再经上述步骤重复萃取2次，得到第2、3次滤液；合并3次滤液，经减压浓缩、冷冻干燥后[9]，分别得到泽泻水提取物、65%乙醇提取物和95%乙醇提取物。

1.3 泽泻提取物的抗氧化活性评价

1.3.1 总抗氧化能力的测定(FRAP法)

FRAP工作液的配制：取TPTZ稀释液1 500 μL、TPTZ溶液150 μL混合均匀，加入检测缓冲液150 μL，即得FRAP工作液，置于37 ℃培养箱中孵育，备用。

标准曲线的绘制：称取27.8 mg FeSO4·7H2O，溶解并定容至1 mL，得到浓度为100 mmol·L-1的FeSO4标准溶液，分别稀释得到浓度为0.15 mmol·L-1、0.30 mmol·L-1、0.60 mmol·L-1、0.90 mmol·L-1、1.20 mmol·L-1、1.50 mmol·L-1的FeSO4标准溶液。向96孔板的每个检测孔加入FRAP工作液180 μL，样品检测孔加入5 μL不同浓度(1.25 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1、20.0 mg·mL-1)的样品溶液，标准曲线检测孔加入5 μL不同浓度的FeSO4标准溶液，空白对照孔加入蒸馏水，阳性对照孔加入Trolox(0.15 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.6 mmol·L-1、0.9 mmol·L-1、1.2 mmol·L-1、1.5 mmol·L-1)；混合均匀，反应3～5 min后，测定593 nm处吸光度，绘制标准曲线，按式(1)计算总抗氧化能力(U·g-1)：

(1)

式中：x为溶液中Fe2+-TPTZ含量，μmol·mL-1；V总为反应总体积，1.02 mL;V样为反应液中样品体积，0.03 mL；c样为样品浓度，mg·mL-1。

1.3.2 羟基自由基清除率的测定(氧化邻二氮菲-Fe2+法)

按照羟基自由基清除能力检测试剂盒说明书，将试剂一0.15 mL、试剂二0.4 mL和试剂三0.1 mL混合均匀，检测管加入不同浓度(1.25 mg· mL-1、2.5 mg· mL-1、5.0 mg· mL-1)的样品溶液0.25 mL和试剂四0.1 mL，对照管加入蒸馏水0.25 mL和试剂四0.1 mL，空白管加入0.35 mL蒸馏水，混合均匀，置于37 ℃培养箱中孵育60 min，10 000 r·min-1离心10 min，测定536 nm处吸光度，按式(2)计算羟基自由基清除率：

(2)

式中：A测、A对和A空分别为检测管、对照管和空白管的吸光度。

1.3.3 超氧阴离子自由基清除率的测定

按照超氧阴离子自由基清除能力检测试剂盒说明书，检测管和对照管加入试剂一40 μL、试剂二160 μL，空白管加入试剂一40 μL、蒸馏水160 μL，充分混匀，25 ℃水浴反应1 min；检测管加入不同浓度的样品溶液100 μL，空白管和对照管加入蒸馏水100 μL，各管均加入试剂三200 μL，混合均匀，置于37 ℃培养箱中反应30 min；各管均加入试剂四和试剂五各200 μL，混合均匀，37 ℃显色20 min，测定530 nm处吸光度，按式(3)计算超氧阴离子自由基清除率：

(3)

式中：A测、A对分别为检测管、对照管的吸光度。

1.4 23-乙酰泽泻醇B含量的测定[10-12]

采用HPLC法测定23-乙酰泽泻醇B含量。色谱条件：Waters T3色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，柱温30 ℃，流动相乙腈-水(1‰甲酸)(27∶73，体积比)，检测波长208 nm，流速1.0 mL·min-1，进样量20 μL。

2 结果与讨论

2.1 泽泻提取物的抗氧化活性评价

2.1.1 总抗氧化能力

对标准曲线进行拟合，得线性回归方程为A=10.18c+0.0061，R2=0.9980。经计算，泽泻水提取物、65%乙醇提取物、95%乙醇提取物的总抗氧化能力分别为0.305 U·g-1、0.313 U·g-1、0.208 U·g-1，即泽泻65%乙醇提取物的总抗氧化能力最高，泽泻水提取物次之，泽泻95%乙醇提取物最低。

2.1.2 羟基自由基清除能力(图2)

从图2可以看出，泽泻不同溶剂提取物对羟基自由基均有一定的清除能力。当浓度为1.25～5.00 mg·mL-1时，泽泻各提取物对羟基自由基的清除率随浓度的增加逐渐升高。当浓度为5.0 mg·mL-1时，泽泻水提取物、65%乙醇提取物、95%乙醇提取物对羟基自由基的清除率分别为46.03%、54.00%、21.13%。

图2 泽泻提取物对羟基自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of extracts of Alisma plantagoaquatica Linn.to hydroxyl free radical

2.1.3 超氧阴离子自由基清除能力(图3)

图3 泽泻提取物对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of extracts of Alisma plantagoaquatica Linn.to superoxide anion free radical

从图3可以看出，3种提取物对超氧阴离子自由基的清除能力较弱，当浓度为5.0 mg·mL-1时，泽泻水提取物、65%乙醇提取物和95%乙醇提取物对超氧阴离子自由基的清除率分别为15.87%、12.90%、31.87%。

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线及线性范围

精密称取23-乙酰泽泻醇B标准品适量，用乙腈分别配制浓度为5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1的23-乙酰泽泻醇B标准溶液，按1.4色谱条件进样测定。以峰面积(y)为纵坐标、23-乙酰泽泻醇B浓度(c,μg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程为：y=16029c-13583，R2=0.9999。表明，23-乙酰泽泻醇B浓度在5～80 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.2 精密度

取23-乙酰泽泻醇B标准溶液，按1.4色谱条件连续进样6次，测得峰面积的RSD为1.54%。表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性

取23-乙酰泽泻醇B标准溶液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h按1.4色谱条件进样测定，测得峰面积的RSD为0.36%。表明23-乙酰泽泻醇B标准溶液在48 h内稳定性良好。

2.3 泽泻各提取物中23-乙酰泽泻醇B含量的比较

HPLC法测定结果表明，泽泻水提取物中不含23-乙酰泽泻醇B，泽泻65%乙醇提取物和 95%乙醇提取物中23-乙酰泽泻醇B含量分别为 0.632%和0.598%，两者含量相近。表明，23-乙酰泽泻醇B集中在泽泻的乙醇提取物中。

3 结论

泽泻水提取物、65%乙醇提取物和95%乙醇提取物均具有一定的抗氧化活性，但对超氧阴离子自由基的清除能力较弱。泽泻水提取物不含23-乙酰泽泻醇B，泽泻65%乙醇提取物和95%乙醇提取物中23-乙酰泽泻醇B的含量相近，但这两种提取物在抗氧化活性方面具有一定差异，可推断泽泻的乙醇提取物中依然有其它物质，需要进一步分析，为泽泻的化学成分分析提供了新思路。