博落回根茎叶挥发油化学成分及抗菌活性研究

2021-01-22李春梅刘冰梅季宇彬

化学与生物工程 2021年1期

李春梅，刘爽，邢丹，刘冰梅，季宇彬*

(1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨 150070;2.哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研工作站，黑龙江哈尔滨 150070；3.济宁医学院医学信息工程学院，山东日照 276826;4.黑龙江省医院南岗分院，黑龙江哈尔滨 150001)

挥发油又称芳香油或精油，是植物经水蒸气蒸馏得到的挥发性油状液体，主要由萜和芳香族化合物及其含氧衍生物组成，少数为脂肪族化合物和杂原子化合物[1]。挥发油是植物的一种次生代谢产物，因其化学组成的特殊性，具有较好的抗氧化、抗菌和杀虫等生物活性，是新型低毒的抗氧化剂、杀菌防腐剂和天然香料的重要来源。挥发油在植物界中分布广泛，其存在部位由于品种不同而表现不同，在植物根、茎、叶、花以及果实的某些器官中具有较高的含量。由于地理位置、环境、农艺条件或者昼夜节律的不同，同种植物的挥发油成分也表现出差异。我国具有丰富的植物资源，为挥发油的研究开发以及利用提供了很好的条件[2]。提取植物挥发油采用水蒸气蒸馏法[3]，测定植物挥发油主要采用气相色谱法[4]、高效液相色谱法、紫外分光光度法[5]以及近红外光谱法[6]等。

博落回[Macleayacortada(Willd) R.Br.]是罂粟科多年生的高大的草本类植物[7]，在我国分布广泛，因产地不同，而有不同的别名约20 多种。博落回的主要生物活性成分是异喹啉类生物碱[8]，可用来治疗人、畜多种感染性疾病，具有抗菌[9]、消炎[10]、清热解毒、增强免疫力、抗肿瘤[11]等多种作用。关于博落回的研究主要集中在生物碱成分的提取分离、含量测定以及药理活性方面[12]，而对于博落回挥发油的药理活性的研究[13]较少。鉴于此，作者采用水蒸气蒸馏法对博落回根、茎、叶等3个部位的挥发油进行提取，利用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[14]对其进行化学成分分析，并初步评价其抗菌活性，拟为博落回资源的开发利用提供科学依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

博落回鲜草，于 2018 年 10 月初采于贵州铜仁地区，经哈尔滨商业大学药学院金哲雄教授鉴定为罂粟科博落回属植物博落回(Macleayacortada(Willd)R.Br.)，储存于哈尔滨商业大学药学院标本室，标本号为20181046。将博落回鲜草的根、茎、叶、果实分开，自然阴干后，粉碎过 40 目筛，于 4 ℃冰箱中保存备用[15]。

氯化钠，天津光复科技发展有限公司；无水乙醇，天津天力化学试剂有限公司；正己烷，天津富宇精细化工有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、碳酸钠、无水硫酸钠、乙醚等试剂均为分析纯；超纯水。

HP6890/5975C 型GC/MS联用仪，美国安捷伦公司；R-201型旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅，常州恒久仪器制造有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义予华仪器有限责任公司； FA2204B型电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；UV-2102PC型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；JP-040ST型洁盟牌超声波清洗机，深圳洁盟清洗设备有限公司。

1.2 供试菌株

革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) ATCC 6633、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC 27217、溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus) ATCC 29213；革兰氏阴性菌：青枯病菌(Pseudomonassolanacearum) GMI 1000、农杆菌(Agrobacterium) ATCC 11158、大肠杆菌(Escherichiacoli) CMCC 44102；真菌：黑曲霉(Aspergillusniger) CMCC 98003；酵母菌:白色念珠菌(Candidaalbicans) ATCC 10231。

1.3 博落回根、茎、叶挥发油的提取[13]

分别称取适量博落回根、茎、叶粉末置于圆底烧瓶中，加入蒸馏水浸泡过夜，挥发油测定器中加入一定量的正己烷，电热套连续加热，水蒸气蒸馏至挥发油测定器中油量不再增加，停止加热，静置片刻，将水缓缓放出，收集正己烷层，常温挥去部分溶剂，得到油相部分。水相部分加氯化钠至饱和后，用无水乙醚萃取3次。将合并后的油相和乙醚萃取液用无水硫酸钠脱水过滤，滤液用旋转蒸发仪回收溶剂，即得具有特殊香味的淡黄色博落回挥发油，根、茎、叶挥发油得率分别为0.0476%、0.0575%、0.0703%，置于冰箱保存备用。

1.4 GC-MS 分析条件[13]

GC条件：色谱柱为ZB-5MSI-5%phenyl-95%dimethylpolysiloxane弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，柱温50 ℃(保持2 min)，以5 ℃·min-1升温至310 ℃(保持8 min)；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压52.5 kPa；载气流量1.0 mL·min-1；分流比40∶1；溶剂延迟时间5.0 min。

MS条件：电子轰击离子源(EI)；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 624 V；接口温度280 ℃；质量范围20～480 amu。

1.5 抗菌活性评价

1.5.1 菌株的培养

采用3株革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌ATCC 6633、金黄色葡萄球菌ATCC 27217和溶血性葡萄球菌ATCC 29213)、3株革兰氏阴性菌(青枯病菌GMI 1000、农杆菌ATCC 11158、大肠杆菌CMCC 44102)、1株真菌(黑曲霉CMCC 98003)和1株酵母菌(白色念珠菌ATCC 10231)进行抗菌活性测定。细菌菌株在LB培养基(酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，pH值 7) 中于37 ℃培养24 h；真菌和酵母菌在马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基中于28 ℃培养48 h。供试菌悬液稀释至106CFU·mL-1后用于检测。

1.5.2 圆盘扩散实验

博落回叶挥发油抗菌活性的测定采用标准圆盘扩散法。挥发油以10 mg·mL-1的初始浓度溶解于DMSO中，经0.45 μm微孔滤膜过滤后灭菌。向无菌试纸(直径6 mm)注射10 mg·mL-1的挥发油溶液10 μL，置于平板上，细菌于37 ℃培养72 h，真菌和酵母菌于27 ℃培养48 h，测定抑菌圈直径。使用1个空盘来测试盘是否无菌，以DMSO为阴性对照，庆大霉素(20 g/盘)为细菌阳性对照，制霉菌素(20 g/盘)为真菌和酵母菌阳性对照。

1.5.3 最小抑制浓度(MIC)的测定

采用连续肉汤稀释法测定MIC。采用连续二倍稀释法制备1 000～7.8 g·mL-1的挥发油溶液，加入到含有1 mL培养基的试管中，再分别加入20 mL供试菌悬浮液(106CFU·mL-1)。细菌、真菌和酵母菌于37 ℃培养24 h。

2 结果与讨论

2.1 博落回根、茎、叶挥发油的化学成分及含量

按GC-MS分析条件，对博落回根、茎、叶挥发油进行检测，得到博落回根、茎、叶挥发油的总离子流色谱图，见图1。

图1 博落回根(a)、茎(b)、叶(c)挥发油的总离子流色谱图Fig.1 Total ion spectra of volatile oil from roots(a),stems(b),and leaves(c) of Macleaya cortada

对总离子流色谱图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对NIST2005和Wiley275标准质谱图，并对检索结果进行人工解析及查对文献。采用峰面积归一化法测定各化学成分的含量，结果见表1。

由表1可知，从博落回根挥发油中共鉴定出52种成分，占挥发油总含量的91.673%。其中含量较高的前10种成分依次是：棕榈酸(21.033%)、肉豆蔻酸(8.917%)、邻苯二甲酸丁酯(8.191%)、月桂酸(5.842%)、4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚(4.874%)、邻苯二甲酸二异辛酯(3.283%)、亚油酸(3.203%)、邻苯二甲酸异丁酯(2.886%)、正十五碳醛(1.884%)、二十八烷(1.874%)。

表1 博落回根、茎、叶挥发油的化学成分及含量

续表1

从博落回茎挥发油中共鉴定出50种成分，占挥发油总含量的99.159%。其中含量较高的前10种成分依次是：棕榈酸(37.516%)、正十五碳醛(8.741%)、邻苯二甲酸丁酯(7.426%)、亚油酸(5.889%)、(E)-9，17-十八碳二烯醛(3.631%)、十九烷(3.568%)、肉豆蔻酸(3.509%)、邻苯二甲酸二异辛酯(3.424%)、邻苯二甲酸异丁酯(2.127%)、十五酸(1.941%)。

从博落回叶挥发油中共鉴定出68种成分，占挥发油总含量的92.549%。其中含量较高的前10种成分依次是：十六醛(20.628%)、叶绿醇(18.508%)、(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯醛(13.510%)、4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚(8.723%)、棕榈酸(4.334%)、β-紫罗兰酮(2.962%)、二氢食用西番(2.725%)、6,10,14-trimethyl-pentadecanone(2.031%)、正十四碳烷(1.889%)、邻苯二甲酸异丁酯(1.819%)。

博落回的根、茎挥发油中含量最高的成分均为棕榈酸，根、茎挥发油成分种类比较接近，但叶挥发油成分与根、茎明显不同，不同部位挥发油含量差异极大。从博落回根、茎、叶等3个部位的挥发油中共鉴定出96种化学成分，仅有24种成分是3个部位共有的，根、茎挥发油共有成分有41种，根、叶挥发油共有成分有30种，茎、叶挥发油共有成分有28种。根、茎、叶挥发油特有成分分别有6种、5种、35种。

2.2 博落回叶挥发油的抗菌活性(表2)

由表2可知，供试菌的抑菌圈直径为(7.7±0.6)～(15.9±0.8) mm，MIC值为125～500 μg·mL-1。其中青枯病菌GMI 1000和金黄色葡萄球菌ATCC 27217对博落回叶挥发油的敏感性较高，其抑菌圈直径分别为(15.9±0.8) mm和(15.1±1.0) mm，MIC值均为125 μg·mL-1。博落回叶挥发油对真菌和酵母菌也有抗菌活性，对细菌和真菌的抗菌活性呈剂量依赖性。博落回叶挥发油对供试菌的抑菌圈直径与MIC值呈显著正相关(P<0.05)。对照治疗(DMSO)没有显示出抗菌活性。

表2 博落回叶挥发油的抗菌活性

2.3 讨论

采用水蒸气蒸馏法提取博落回挥发油，利用GC-MS法共鉴定出96种成分，可见博落回挥发油的化学成分比较复杂。博落回根、茎、叶等3个部位的挥发油成分存在极大差异，96种成分中，3个部位的共有成分只有24种，根、茎挥发油共有成分有41种，根、叶挥发油共有成分有30种，茎、叶挥发油共有成分有28种。根挥发油特有成分有6种，茎挥发油特有成分有5种，叶挥发油特有成分有35种。博落回叶挥发油的抑菌圈直径为(7.7±0.6)～(15.9±0.8) mm，MIC值为125～500 μg·mL-1，说明博落回叶挥发油具有一定的抗菌活性。博落回挥发油中含有丰富的香料、药用等化学成分，具有重要的开发利用价值。其中博落回叶挥发油的主要成分十六醛(棕榈醛)(20.628%)主要用于调制化妆品香精，以及杏、桃、莓等果香型香精；(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯醛(13.510%)是美国白蛾性信息素中两个主要成分之一，应用于预报、监测和防治美国白蛾等方面，并且已经获得了较好的效果；β-紫罗兰酮(2.962%)是一种极其重要的香料，用于皂用香精，也是合成维生素A的原料，常用于烘烤食品、冰冻乳制品、布丁。根、茎挥发油中的棕榈酸(21.033%、37.516%)有较强的抗肿瘤作用，能引起人成骨肉瘤细胞MG63凋亡[16]。