PCR-Sanger测序法在幽门螺杆菌感染个体化治疗中的应用研究

周晴接 孟飞 朱丽明 蒋晓芬 朱方超 潘杰

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌及胃黏膜相关淋巴组织样淋巴瘤的主要致病因子，根除Hp对治疗和预防上述疾病具有重要意义[1]。然而，随着抗生素的广泛使用，Hp对常用抗生素的耐药率越来越高，传统Hp根除治疗方案的根除率越来越低。目前Hp根除治疗失败的原因包括抗生素的选择、患者依从性、地区因素、宿主因素、质子泵抑制剂（PPI）代谢等，其中细菌耐药是最主要的原因。因此，如何正确选择抗生素并制定个体化治疗方案是根治Hp的关键。研究发现Hp的耐药性与其相应的基因耐药位点相关，如23S rRNA基因（克拉霉素耐药位点）、gyrA基因（喹诺酮耐药位点）等，通过对Hp进行耐药基因测序，即可得到该耐药位点的信息，从而推断出耐药情况[2-3]。本研究通过双脱氧链终止法（PCR-Sanger）测序检测Hp并获得耐药基因23S rRNA与gyrA的突变情况，推断出Hp对克拉霉素与左氧氟沙星的耐药情况，从而选择敏感抗生素进行个体化治疗，以期提高Hp的根除率。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年1至6月因各种消化道症状于温州市中心医院就诊且13C尿素呼气试验阳性提示存在Hp感染的患者200例，依据“第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告”推荐[4]，所有患者均符合Hp根除治疗指征。纳入标准：（1）年龄18～70岁，男女不限，均为初治患者；（2）因腹痛、腹胀、反酸、嗳气、恶心、呕吐、烧心、胸痛、呕血、黑便等各种不适症状就诊；（3）4周内未使用抗生素、铋剂、H2受体拮抗剂或PPI制剂；（4）同意行胃镜检查取胃黏膜活检组织标本进行Hp PCRSanger测序、细菌培养及药敏试验；（5）同意进行Hp根除治疗，并愿意配合医生进行根除疗效的随访调查。排除标准：（1）严重心、肝、肾功能损害者；（2）妊娠或哺乳期妇女；（3）有上消化道活动性出血、穿孔、幽门梗阻、癌症并发症者；（4）有食管、胃肠手术史者；（5）患者不能正确表达自己的主诉，如精神病、严重神经官能症者；（6）同时服用非甾体抗炎药或酗酒者；（7）对阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、呋喃唑酮等4种抗生素任一种过敏者。将所有患者按随机数字表法分为个体化治疗组与经验治疗组两组，每组100例。本研究经温州市中心医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 标本采集 常规胃镜检查后选择胃窦小弯侧距幽门5 cm内的黏膜深部组织，在相近部位（1 cm以内）取3块胃黏膜组织，分别用于Hp PCR-Sanger测序、细菌培养及组织病理学检查。

1.3 Hp检测方法

1.3.113C尿素呼气试验 空腹或禁食2 h以上的患者正常吹气至气袋饱满（0 min呼气）；之后，彻底漱口并服用13C尿素颗粒，静坐30 min再次收集气体（30 min呼气）；分别对两次呼气的13CO2进行检测，并依据两次检测值差值判定患者呼气试验结果。检测值≥4.0判定为阳性，＜4.0判定为阴性。

1.3.2 PCR-Sanger测序 （1）全基因组提取：将胃黏膜组织研磨后采用美国Life Technologies公司的Invitrogen Purelink Genomic DNA Mini Kit试剂盒进行人和细菌的全基因组提取，12 000 r/min离心3 min，去除上清液，加入专用裂解液和钢珠进行细胞破碎，随后95℃金属浴10 min，结束后立即放入4℃冰箱冷却30 min，最后12 000 r/min离心10 min，吸出上清液即为全基因组，提取到Hp全基因组断定为阳性，否则判定为阴性。（2）耐药基因扩增：使用23S rRNA和gyrA基因引物（表1）对耐药基因23S rRNA和gyrA进行PCR扩增。（3）Sanger测序：使用3730XL测序仪对23S rRNA和gyrA基因的PCR产物进行测序。（4）耐药基因测序结果分析：采用chromas和Sequencing Analysis5.2软件进行序列分析，得出Sanger测序峰图，对每个样本的23S rRNA（A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C），gyrA（Asn87Lys、Ala88Val、Asp91Gly/Asn/Ala/Tyr）突变位点进行分析，给出耐药性，突变判定为耐药，未突变判定为敏感（图1-4，插页）。

图1 克拉霉素未突变株测序图

图2 克拉霉素A2143G纯合突变株测序图

图3 喹诺酮类81位未突变、Asn91位未突变株测序图

图4 喹诺酮类Asn87Lys杂合突变、91位未突变株测序图

1.3.3 细菌培养及药敏试验 （1）Hp分离培养：胃黏膜组织经充分研磨后，接种于哥伦比亚血琼脂平板（5%脱纤维绵羊血），37 ℃三气培养箱中（5% O2、10% CO2、85% N2）微需氧环境下培养 96 h；（2）Hp鉴定：可疑菌落经肉眼观察、革兰染色镜检、尿素酶试验、过氧化氢酶和过氧化物酶试验阳性者，为Hp菌株，判定为阳性，否则判定为阴性。（3）Hp药敏试验：根据美国实验室标准化协会推荐方法，采用耐药临界点药物琼脂稀释法进行药敏试验，将抗生素溶液加入琼脂中稀释成相应的临界点浓度，倾注平板，接种菌悬液，若接种点有菌生长则该菌株判定为耐药，否则判定为敏感。

表1 耐药基因测序引物序列

1.4 分组处理 个体化治疗组所有患者均予行胃镜检查及病理活检，并同时行Hp PCR-Sanger测序、细菌培养及药敏试验，对比分析测序法与细菌培养法检测Hp的阳性率及药敏结果；测序阳性患者予测序方案治疗（抗生素选择阿莫西林+克拉霉素与左氧氟沙星中任一敏感者，如均耐药，则选择呋喃唑酮），即艾司奥美拉唑肠溶片（耐信片：中国阿斯利康制药有限公司，国药准字H20046379，20 mg/7 片/盒）1 片/次，2 次/d＋胶体果胶铋胶囊（胶体果铋胶囊：山西振东安特生物制药有限公司，国药准字 H20058476，100 mg/48 片/盒）2 片/次，2次/d＋阿莫西林胶囊（阿莫仙：珠海联邦制药股份有限公司中山分公司，国药准字 H44021351，250 mg/24 片/盒）4 片/次，2次/d＋克拉霉素缓释片（诺邦：江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20031041，500 mg/3 片/盒）1片/次，2次/d或左氧氟沙星片（可乐必妥：北京第一三共制药有限公司，国药准字 H20040091，500 mg/4 片/盒）1 片/次，1 次/d或呋喃唑酮片（痢特灵：上海金不换兰考制药有限公司，国药准字 H41021628，100 mg/100 片/瓶）1 片/次，2 次/d。经验治疗组患者未行PCR-Sanger测序，其余检测方法相同，给予经验方案治疗，即艾司奥美拉唑肠溶片1片/次，2次/d＋胶体果胶铋胶囊2片/次，2次/d＋阿莫西林胶囊4 片/次，2次/d＋克拉霉素缓释片 1片/次，2次/d。两组患者疗程均为14 d，停药后4～8周后复查13C呼气试验确定Hp是否已根除成功。治疗过程中对所有患者进行随访，记录患者的基本信息、检查结果、用药情况、药物不良反应及Hp根除治疗结果，对比分析两组患者的Hp根除率。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；采用意向性分析（ITT）与遵循研究方案分析（PP）评价疗效；P＜0.05为差异有统计学意义。采用Kappa检验对个体化治疗组PCR-Sanger测序与药敏试验结果进行一致性分析；Kappa值≥0.75说明两种方法诊断结果一致性较好；0.4≤Kappa值＜0.75说明两种方法诊断结果一致性一般；Kappa值＜0.4说明两种方法诊断结果一致性较差。

2 结果

2.1 个体化治疗组患者Hp检测结果分析 个体化治疗组患者中男43 例，女 57 例，年龄 20～70（44.13±12.17）岁；胃镜检查及病理活检结果显示，个体化治疗组均存在慢性胃炎，其中慢性活动性胃炎81例，伴慢性萎缩性胃炎30例，伴胃或十二指肠溃疡20例；PCR-Sanger测序法检测Hp的阳性率为80.00%（80/100），明显高于细菌培养法的44.00%（44/100），差异有统计学意义（P＜0.05）。其中慢性活动性胃炎患者的PCR-Sanger测序法与细菌培养法检测Hp的阳性率均明显高于慢性非活动性胃炎患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而在慢性萎缩性胃炎与慢性非萎缩性胃炎、伴胃十二指肠溃疡与不伴胃十二指肠溃疡的患者之间两种检测方法的阳性率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 个体化治疗组Hp检测结果分析（例）

另外，PCR-Sanger测序阳性80株菌株的耐药基因测序结果分析显示，克拉霉素耐药31例，耐药率38.75%（31/80），左氧氟沙星耐药34例，耐药率42.50%（34/80）；细菌培养阳性44株菌株的体外药敏结果显示，克拉霉素耐药10例，耐药率22.73%（10/44），左氧氟沙星耐药12例，耐药率27.27%（12/44）。细菌培养阳性44例中仅1例测序阴性，即两种检测方法均阳性43例。Kappa分析结果显示，两种检测方法对克拉霉素及左氧氟沙星药敏情况诊断的一致性分析Kappa值分别为0.532及0.641，提示两种检测方法诊断结果的一致性一般，见表3。

2.2 两组患者Hp根除治疗情况分析 个体化治疗组PCR-Sanger测序阳性80例患者根据测序结果给予测序方案治疗，测序阴性20例患者予经验方案治疗，但不纳入治疗阶段研究，而经验治疗组100例患者均给予经验方案治疗，故共180例患者纳入治疗阶段研究。其中男 80 例，女 100 例，年龄 20～70（46.19±12.08）岁。个体化治疗组共有9例患者被剔除或失访，其中因服用克拉霉素后出现心悸1例，口服呋喃唑酮后出现皮疹或恶心无法继续治疗2例，治疗不规范或失访6例；经验治疗组因治疗不规范或失访被剔除12例；两组均有部分患者（个体化治疗组12例，经验治疗组18例）服用克拉霉素后出现口苦，但均未出现无法继续治疗的严重不良反应。最终，按PP，个体化治疗组Hp根除率90.14%（64/71）明显高于经验治疗组的77.27%（68/88），差异有统计学意义（P＜0.05）；按ITT，个体化治疗组Hp根除率80.00%（64/80）与经验治疗组的 68.00%（68/100）比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表 4。

表3 Hp PCR-Sanger测序与药敏试验结果一致性分析（例）

表4 两组患者Hp根除治疗结果分析（例）

3 讨论

现在普遍认为满意的Hp根除治疗方案的根除率应达85%以上，且不引起严重的临床不良反应和细菌耐药性。近年来，随着Hp体外细菌培养及药敏试验在临床上的广泛开展，根据药敏试验结果选择敏感抗生素进行个体化治疗越来越受到重视。大量研究显示，根据药敏试验结果制定的Hp根除治疗方案可显著提高根除率[5-6]。然而，由于受到标本采集、保存、运送、分离培养等多方面因素的影响，目前Hp体外培养的阳性率并不高，有文献报道医院就诊患者的培养阳性率仅为34.17%（17 731/51 891）[7]，明显低于 Hp 平均感染率（约 50%）[8]。这部分培养阴性的Hp感染患者只能采用经验性方案进行根除治疗，导致根除率降低或出现严重不良反应，无法达到理想的治疗效果。因此，想要提高这部分患者的Hp根除率，就需要一种灵敏度高且能检测耐药情况的检测技术。

荧光PCR技术是一种直接检测核酸的分子生物学技术，具有灵敏度、特异度高、操作简单、能够早期检测病原体的优点，目前已广泛应用于Hp的检测[9]；PCRSanger测序法是目前应用最多的核酸测序技术，具有高度的准确性，是基因检测的金标准，目前已广泛应用于Hp的全基因组测序[10]。本研究结果显示，PCR-Sanger测序法检测Hp的阳性率为80.00%，仍有20.00%的假阴性率，考虑可能与PCR-Sanger测序法只取1块胃黏膜组织进行基因提取与扩增有关，但其阳性率明显高于细菌培养法的44.00%，提示PCR-Sanger测序法相对于细菌培养法能显著提高Hp检测的灵敏度，弥补细菌培养法灵敏度不高的缺点，使培养阴性的Hp感染患者也可以通过PCR-Sanger测序法分析选择敏感抗生素进行个体化治疗，从而提高Hp根除成功率。此外，目前临床上应用的细菌培养及药敏试验检测的周期需要10 d，而PCR-Sanger测序法仅需3 d，可显著提高检测效率，从而提高患者的依从性，避免因检测周期过长导致的患者失访或治疗不规范。

一项纳入12篇RCT研究的荟萃分析结果表明[11]，含铋剂经验四联疗法的根除率为77.6%，而含克拉霉素经验三联疗法的根除率仅为68.9%，均无法达到满意的根除治疗效果。目前Hp根除治疗失败的原因主要是由于Hp对常用的抗生素耐药[12]。近些年报道推荐用于Hp根除治疗的6种抗生素中，甲硝唑耐药率达到40%～70%，克拉霉素达到20%～50%，左氧氟沙星达到20%～50%，而阿莫西林、呋喃唑酮和四环素的耐药率仍很低（1%～5%）[4]。其中，甲硝唑因耐药率太高，呋喃唑酮与四环素因药物不良反应及安全性问题，均已很少作为临床一线使用；目前临床上使用最多的抗生素是阿莫西林、克拉霉素及左氧氟沙星，因此Hp对左氧氟沙星与克拉霉素的耐药情况与根除治疗结果密切相关，如果能在治疗前检测出Hp对这两种抗生素的耐药情况，即可选择敏感抗生素进行根除治疗。

本研究通过PCR-Sanger测序法得出Hp对克拉霉素与左氧氟沙星的耐药情况，从而制定个体化方案进行根除治疗。结果显示，个体化治疗组Hp的根除率按PP达到90.14%（64/71），明显高于经验治疗组的77.27%（68/88），提示根据Sanger测序结果的个体化治疗方案可显著提高Hp的根除率；而个体化治疗组与经验治疗组的Hp根除率按ITT分别为80.00%（64/80）及68.00%（68/100），个体化治疗组Hp根除率高于经验治疗组，但两组间比较差异无统计学意义，分析原因可能与本研究的样本量相对较少以及失访率相对较高有关。同时，Kappa分析结果显示，两种检测方法对克拉霉素及左氧氟沙星药敏情况诊断结果的一致性一般，提示诊断Hp耐药情况的基因型与表型之间可能还是存在一定的差异，也可能与本研究的样本量相对不足有关，有待后续的大样本研究加以证实。

综上所述，PCR-Sanger测序法检测Hp不仅灵敏度高，且检测周期短、效率高，同时能分析Hp对克拉霉素与左氧氟沙星的耐药情况，从而制定个体化治疗方案，能显著提高Hp根除率。