基于突触和突触蛋白探讨复方金思维对拟散发性阿尔茨海默病小鼠早期突触传递和功能的影响

巩卓彦 吴艺琼 黄帅阳 刘珍洪 秦高凤 王蓬文

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)起病隐匿并呈进行性发展趋势，主要临床表现为认知、生活及行为功能障碍，病变累及多个系统。突触信号传递蛋白在神经信号的正常传递方面起到重要影响作用，其功能的缺失会进一步改变认知能力[1]。AD所发生的某些病理改变与谷氨酸受体缺陷有关[2]，其亚型代谢性谷氨酸受体5 (metabotropic glutamate receptors5, mGluR5)是突触后膜介导Aβ寡聚体(A beta oligomers, Aβo )产生细胞毒性，破坏突触正常传递功能并产生认知障碍的必要受体蛋白。研究胆碱能信号蛋白在突触中的变化可以帮助进一步认识AD[3]。烟碱型乙酰胆碱受体家族中的α7尼古丁乙酰胆碱受体(α7-nicotinic acetylcholine receptors,α7-nAChRs)位于突触前膜和后膜，前膜的α7-nAChRs调控释放神经递质，后膜的α7-nAChRs在包括主导学习记忆功能的海马在内的多个脑区域调控突触可塑性。突触是AD病理变化出现的最早部位，在Aβ影响下其功能发生了改变，研究突触的改变不仅能够认识早期AD病理变化，而且可以帮助寻找治疗AD的有效靶标。

中药复方金思维是一种自草药提取的混合物，由田金洲教授研究团队在中国工程院院士王永炎教授指导下研制而成，其中包括由人参中的人参皂苷，来自菖蒲的细辛醇，远志的细叶远志皂苷，来自淫羊藿的黄酮苷，郁金中的姜黄素等八种有效成分[4-5]。轻度认知功能障碍是AD前认知功能的中间状态，中药复方金思维能够显著改善遗忘型轻度认知功能障碍患者的认知功能[6]；研究发现中药复方金思维能通过抑制APPV717I小鼠脑内早老素1活性和促进胰岛素降解酶和脑啡肽酶活性来降低Aβ水平[7]；有研究发现中药复方金思维能通过增加AD模型大鼠海马区GAP-43表达影响突触可塑性[8]。然而，尚不清楚早期突触传递和突触功能障碍在中药复方金思维改善早期认知损害中是否发挥重要作用，因此研究旨在通过观察中药复方金思维干预下拟散发性AD小鼠脑内突触蛋白α7-nAChRs和mGluR5的表达变化，探讨中药复方金思维对AD病理变化中突触传递和功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及设备

复方金思维为专利制剂[9](专利号：2008100067330)(药物组成：人参、肉苁蓉、地黄、茯苓、石菖蒲、郁金、丹参和远志)，由北京中医药大学东直门医院药房制备；盐酸多奈哌齐购自卫材(中国)药品有限公司，药品批号：140625；羟甲基纤维素钠由北京精求化工有限公司提供，批号：3405005；2.5%戊二醛和0.1MPB缓冲液购自北京陆军总医院；叔戊醇和多聚甲醛由北京化学试剂公司提供；一抗兔抗小鼠α7-AchR抗体(免疫组化抗体滴度1∶200)和mGluR5抗体 (免疫组化抗体滴度1∶500，Western blot抗体滴度1∶7500)由Abcam公司提供；Western-blot所用RIPA裂解液，批号：R0010；1M、1.5M Tris-HCL缓冲液，批号：A1010，T1020；SDS溶液，SDS-PAGE凝胶配置试剂盒，链脲佐菌素(Sigma)均由北京索莱宝科技有限公司提供；免疫组化所用柠檬酸盐，货号：ZLI：9064，RT；PBS缓冲液粉剂，货号：9061；兔二步法试剂盒，货号：PV-9001；小鼠二步法试剂盒，货号：PV-9002，均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；Morris水迷宫测试及相关分析仪器购自上海移数信息科技有限公司；JEM-2100F型透射电镜来自日本日立电子公司。

1.2 动物

实验动物来自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号(京)：2012-0001]。雄性3月龄C57/BL6J小鼠，共计90只。由北京中医药大学东直门医院屏障环境动物室[实验动物使用许可证号(京)：2015-0001]负责饲养，每日按时灌胃，小鼠自由饮水进食，定期更换垫料。本研究所用实验动物经由北京中医药大学东直门医院动物伦理委员会准许(伦理编号：16-13)。

1.3 动物分组及给药

将90只C57/BL6J小鼠随机分为6组(每组15只)：对照组、模型组、多奈哌齐组[0.92 mg/(kg·d)]及复方金思维大、中、小剂量组[20 mg/(kg·d)，10 mg/(kg·d)，5 mg/(kg·d)]。第1和第3天进行双侧侧脑室造模：用叔戊醇对小鼠进行麻醉，剪掉头顶上的毛发并用酒精消毒，沿中线剪开小鼠头皮并暴露前囟，以前囟旁侧1.0 mm和后侧0.3 mm为坐标，向下进针2.5 mm，利用微量注射器注入3 μL液体。除对照组其余5组小鼠按照3 mg/kg浓度注射链脲佐菌素(Streptozocin, STZ)，对照组小鼠按照相同方法双侧侧脑室注射等量生理盐水[10-12]。造模1个月后给药，每日定时灌胃，持续3个月。

1.4 Morris水迷宫测试

Morris水迷宫实验中，第1天和第2天为训练阶段，第3天至第5天为测试阶段，本次实验旨在测试小鼠在训练阶段定位航行潜伏期的时间。

1.5 透视电镜观察

Morris水迷宫实验结束，对小鼠(3只/组)进行灌注固定，断颈，在冰上迅速剥离海马，用2.5%戊二醛溶液进行固定，4℃静置2小时，用PBS缓冲液冲洗3次。将海马组织制成超薄切片，在×7000倍数视野下观察小鼠海马CA1区突触超微结构，并对突触的形态学变化进行分析。

1.6 Western blot检测

Morris水迷宫实验结束，对小鼠(6只/组)进行麻醉并进行断颈处死，迅速取出海马并置于EP管中并在液氮罐中保存。对组织进行蛋白提取并对其浓度进行测定；配胶并上样；电泳跑浓缩胶时用60 V，使样品压成一条线，跑到分离胶以后用120 V跑，根据所要检测的蛋白分子量大小来决定最终电泳停止的时间；转膜后进行杂交，做杂交前应先进行膜封闭，然后进行抗体孵育；使用HRP-ECL发光法进行发光鉴定；用Hp Scanjet G4050仪器进行扫描并保存为TIF格式，并基于 Image J、Excel 软件对其进行分析，得到相对百分数结果，基于 Prism 软件制作柱状图进一步说明结果数据。

1.7 免疫组化检测

Morris水迷宫实验结束，对小鼠(6只/组)进行灌注固定，断颈处死，迅速脑组织用多聚甲醛固定液进行固定，石蜡包埋后从冠状面切成4m薄片，接着进行烤片、脱蜡、消除内源性过氧化物酶、抗原修复、抗体孵育、显色、脱水、封片，最后每组选6张切片在×20倍显微镜视野下观察海马CA1区α7-nAChRs和mGluR5阳性细胞，并利用Image-pro Plus软件进行分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 复方金思维对小鼠定位航行潜伏期的影响

实验结果显示，随着训练次数的增加每组小鼠定向航行潜伏期均缩短，具体表现如下：实验期间，与对照组比较，模型组潜伏期明显增加(P<0.01)；与模型组相比较，第四天，多奈哌齐组和复方金思维小剂量组潜伏期均缩短(P<0.01或P<0.05)；第五天，与模型组相比，多奈哌齐组和金思维各剂量组潜伏期均减短(P<0.01或P<0.05)。结果见表1。

表1 复方金思维对各组小鼠定位航行潜伏期的影响

2.2 复方金思维对小鼠突触结构的影响

电镜×7000倍视野下观察小鼠突触超微结构，结果显示：对照组突触结构正常且清晰，突触前膜有大量球形突触小泡，可见清晰的线粒体，突触间隙宽度及形态正常，突触后膜厚度正常且均匀(图1A)；模型组突触形态结构不完整，突触内线粒体结构不清晰，突触小泡分布零散且形态模糊(图1B)；多奈哌齐组突触结构清晰，前膜和后膜形态正常，可见较为清晰的线粒体结构，突触间隙宽度正常(图1C)；复方金思维各药物组突触形态及结构均基本正常，其中中剂量组可见结构完整且清晰的线粒体，小剂量组突触前膜可见大量清晰的突触小泡聚集，各组突触间隙均宽度及形态正常(图1D-F)。结果见图1。

2.3 小鼠海马CA1区α7-nAChRs和mGluR5阳性细胞数的变化

在×20倍显微镜视野下观察海马CA1区α7-nAChRs和mGluR5阳性细胞，实验结果显示：α7-nAChRs阳性细胞变化为：与对照组相比，模型组海马CA1区阳性细胞数表达显著减少(P<0.01)(图2A、2B)；与模型组相比较，其他各药物组海马阳性细胞分布均较多(图2C-F)，多奈哌齐组和复方金思维大剂量组表达均有所增加(P<0.05)。mGluR5阳性细胞变化为：与对照组相比，模型组阳性细胞数表达显著增加(P<0.01)(图3A、3B)；与模型组相比较，其他各药物组海马阳性细胞分布较少(图3C-F)，多奈哌齐组，复方金思维大、中剂量组表达均有所减少(P<0.01或P<0.05)。综合上述结果，多奈哌齐组和复方金思维大剂量组与模型组比较，海马CA1区α7-nAChRs和mGluR5的阳性细胞数表达均有一定程度改善(P<0.05)。结果见图2，图3，表2。

注：A.对照组;B.模型组;C.多奈哌齐组;D.复方金思维大剂量组;E.复方金思维中剂量组;F.复方金思维小剂量组

注：A.对照组;B.模型组;C.多奈哌齐组;D.复方金思维大剂量组;E.复方金思维中剂量组;F.复方金思维小剂量组

注：A.对照组;B.模型组;C.多奈哌齐组;D.复方金思维大剂量组;E.复方金思维中剂量组;F.复方金思维小剂量组

表2 复方金思维对各组小鼠海马CA1区α7-nAChRs和mGluR5阳性细胞数表达的影响

2.4 通过Western-blot实验观察小鼠海马CA1区mGluR5的变化

实验结果显示，与对照组比较，模型组海马CA1区该蛋白的表达有所增加(P<0.05)；与模型组比较，多奈哌齐组及复方金思维大、中剂量组小鼠海马CA1区该蛋白的表达均有一定程度减少(P<0.01或P<0.05)。结果见表3，图4。

表3 复方金思维对各组小鼠海马CA1区mGluR5蛋白表达的影响

注：A.对照组；B.模型组；C.多奈哌齐组；D.复方金思维大剂量组；E.复方金思维中剂量组；F.复方金思维小剂量组

3 讨论

突触是神经元的特殊结构，神经递质从突触前轴突释放到突触间隙中，并激活突触后树突上的受体以传递信号[13]。随着AD病情的发展，认知功能逐步恶化，突触丢失尤为突出，特别是在海马和皮层中。研究证明淀粉样蛋白如Aβ和tau蛋白的沉积可能是导致AD早期发病阶段出现突触衰竭的发病机制[14]。除此之外，AD中突触丢失的机制还可能涉及轴突运输缺陷，氧化应激，线粒体损伤和神经炎症等[15]。在神经传递过程中，信号分子如谷氨酸、乙酰胆碱、多巴胺等从突触前神经元的活动区域释放出来，与突触后神经元的受体结合并激活受体。本实验重点讨论的突触蛋白α7-nAChRs和mGluR5分别在神经信号传递中起重要作用[16]。尼古丁乙酰胆碱受体是调节学习和记忆功能的胆碱能信号重要介质[17]，尼古丁乙酰胆碱受体的激活会增加小胶质细胞对Aβ的吞噬作用，其亚型α7-nAChRs是调节兴奋性神经递质的重要蛋白，能够提高学习记忆能力[18]。α7-nAChRs是一种配体门控离子通道受体，在细胞Ca2+信号传导中起重要作用，通过G蛋白支架分子选择性地作用于神经元。除此之外，Aβ能够与α7-nAChRs高度结合并阻碍正常的α7-nAChRs通道进而影响其正常功能。研究表明α7-nAChRs受体激动剂激活可以触发Ca2+通道信号[19]，促进突触发育和可塑性，因此α7-nAChRs是治疗AD等神经退行性疾病的关键药物靶点。在AD病理变化中另一重要变化是Aβ对谷氨酸系统的影响[20]，谷氨酸作为哺乳动物中枢神经系统中一种主要的兴奋性神经递质，是影响突触进行神经信号传递的重要物质，谷氨酸受体存在于神经元和神经胶质细胞中，不同于离子型谷氨酸受体，与膜内G蛋白偶联的代谢性谷氨酸受体通过间接代谢过程激活进行兴奋性传递，mGluR5受体主要在突触后表达，激活该受体能够促进Gαq/11蛋白活化，进而激活磷脂酶Cβ1，导致甘油二酯和三磷酸肌醇形成，促进Ca2+从细胞内释放， Aβo 的慢性堆积可能会降低mGluR5对Ca2+的敏感性。在突触后密集区(postsynaptic density, PSD)，细胞外Aβo与脂锚定蛋白细胞朊蛋白(cellular prion protein , PrPc)共同激活酪氨酸蛋白激酶Fyn从而干扰突触信号传递，在所有的跨膜PSD蛋白中，只有mGluR5支持Aβo-PrPc与Fyn激活的偶联。细胞内Ca2+和蛋白质的翻译也通过mGluR5的介导与Aβo-PrPc过程产生关联[21]。树突棘丧失和转基因记忆障碍需要mGluR5发挥辅助受体作用。总之，mGluR5激活是Aβo信号转导的关键步骤，具有AD治疗干预的潜力。

作为21世纪最严重的全球健康和社会危机之一的疾病，AD目前还没有治疗及治愈的方法，寻求有效治疗方法和药物，迫在眉睫。中医药治疗AD独具优势。AD基本中医病机为髓海亏虚，痰瘀阻滞，情志所伤以及瘀阻脑络所致脑失所养，神明失用。髓海空虚和痰瘀阻络是AD最典型的基本病机，在此基础之上，中药复方金思维针对肾虚和痰浊的病机，根据补肾助阳，化痰祛浊的治疗原则组方用药[22]，方中人参大补元气，安神益智，肉苁蓉补肾阳，益精血，地黄填精益髓，补肾滋阴，茯苓补肾益精，石菖蒲和远志豁痰开窍，醒神益智，郁金和丹参活血化瘀，养血安神，诸药共奏补肾助阳，化痰祛浊之效，针对其肾虚之本和痰浊之标进行治疗。

本实验通过Morris水迷宫测试小鼠学习记忆能力，结果显示随着训练次数的增加每组小鼠定向航行潜伏期均缩短；超微电镜观察结果显示与模型组相比，复方金思维药物组小鼠海马CA1区突触结构有不同程度改善；通过免疫组化、Western-blot实验观察拟散发性AD小鼠海马CA1区α7-nAChRs和mGluR5的表达和分布，免疫组化实验结果显示，与对照组相比，模型组海马CA1区α7-nAChRs的阳性细胞数表达显著减少，mGluR5的阳性细胞数表达显著增加；与模型组相比较，多奈哌齐组和复方金思维大剂量组α7-nAChRs的阳性细胞数均有所增加，mGluR5有所减少，复方金思维中剂量组mGluR5的阳性细胞数也减少；Western-blot mGluR5实验结果与免疫组化结果方向一致。这些结果说明中药复方金思维能够从一定程度上改善AD小鼠海马区CA1区α7-nAChRs和mGluR5的分布和表达，推测可能是通过影响突触结构和突触传递信号中相关蛋白进一步影响突触传递及功能，改变AD病理表现，改善AD认知能力。