半夏泻心汤对小鼠Cajal间质细胞表型维持及相关钙离子通道蛋白的影响

王飞 陆瑞敏 王淑艳 王梦薇 张迪 王启航 李丽娜 陈萌

Cajal间质细胞(interstitial cells of cajal，ICC)介于肠神经系统和平滑肌细胞之间的“起搏细胞”，参与胃肠动力的调节[1]。实验表明，许多胃肠动力障碍性疾病都伴随着ICC数量减少或网络结构的破坏[2]，同时ICC数量减少或结构异常也会引发胃肠功能障碍疾病[3]。目前，关于胃肠动力障碍疾病，治疗手段单一，“心下痞”与现代医学胃肠功能障碍之病状十分相似[4]，而半夏泻心汤为医治“心下痞”的经方，临床效果显著。已有研究表明，ICC受炎症、氧化应激、梗阻等影响，可导致“典型”的表型丧失，但其表型具有可塑性[5]。因此，本研究从细胞分子角度入手，观察半夏泻心汤对ICC表型维持蛋白及其相关钙离子通道蛋白的影响，探索半夏泻心汤治疗胃肠动力障碍性疾病的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物

新生小鼠原代胃cajal间质细胞(拓普生物，批号：TOPCP1024)；清洁级雄性SD大鼠30只，体重(200±20)g，购于斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0002。常规饲养于北京中医药大学中医学院清洁级动物房。

1.2 药物与试剂

半夏泻心汤中药免煎颗粒购于北京康仁堂药业有限公司；兔抗c-Kit多克隆抗体(批号：D13A2)、山羊抗兔488标记荧光二抗(批号：A23220)购自美国Cell Signaling公司；c-Kit Antibody(批号：SC-365504)购自美国Santa公司；Desmin antibody(批号：16520-1-AP)购自中国proteintech公司；SMMHC antibody(批号：ab125884)、α-SMA antibody(批号：ab5694)购自美国Abcam公司；Dylighe 549, Goat Anti-Rabbit IgG(批号：A23320)、Dylighe 649,Goat Anti-Mouse IgG(批号：A23610)购自美国Abbkine公司；Total RNA Extraction Kit(批号：GPQ1801)、mRNA cDNA Synthesis Kit(批号：GPQ1803)、mRNA/lncRNA qPCR Kit(批号：GPQ1808)、Protein Extraction Kit(批号：GPP1815)、SDS-PAGE Gel Kit(批号：GPP1816)、ECL Plus Western Blot Kit(批号：GPP1824)均购自北京GenePool公司。

1.3 设备仪器

TCS-SP8型莱卡激光共聚焦显微镜(日本SANYO公司)、NANODROP 2000型分光光度计(美国Thermo scientific)、Line Gene 9600 Plus型荧光定量PCR仪(杭州Bioer Technology)、MP-8001型双垂直电泳槽、MP-3030型转移槽、PP-1150型电泳仪(北京CAVOY公司)。

1.4 药物血清制备

半夏泻心汤生药比例按原著换算[6]，并按照人的单位体重生药量进行换算求得大鼠单位体重的生药量，具体如下：半夏14 g，炙甘草、黄芩、干姜、党参各15 g，大枣10 g，黄连5 g。按生药量换算成免煎颗粒。30只SD大鼠常规条件喂养3天，随机分为半夏泻心汤组和对照组。分别给予半夏泻心汤和去离子水灌胃，剂量为5 mL/(kg·d)，连续7天。末次给药2小时后，腹主动脉无菌取血，离心取血清。

1.5 细胞分组及干预

ICC细胞复苏传至3代，取对数生长期的细胞，以3×104个/皿的浓度接种于3.5 cm激光共聚焦专用培养皿中，37℃、5% CO2培养箱中孵育36小时，镜下观察细胞状态是否稳定，并随机标记分为空白组、对照组(10%去离子水大鼠血清)、低浓度组(5%半夏泻心汤药物血清)、中浓度组(10%半夏泻心汤药物血清)、高浓度组(20%半夏泻心汤药物血清)。每组各设6个复孔，给予相应药物干预后，37℃、5% CO2培养箱中继续培养12小时、24小时和48小时。

1.6 激光共聚焦显微镜观察ICC表型维持的情况

分别于12小时、24小时和48小时，漂洗、固定、透膜处理后，加入5%正常山羊血清37℃封闭60 分钟。按顺序加入一抗4℃冰箱过夜，二抗室温孵育60分钟。漂洗后，加入DAPI染细胞核室温孵育10分钟。PBS洗三遍，每孔加入0.5 mL PBS，在激光共聚焦显微镜相同设置下进行检测，应用Image Pro Plus V6.0专用图片分析软件，测定阳性反应荧光的灰度值。比较三组与对照组灰度值差异。

1.7 Western Blot法检测钙离子通道蛋白IP3R、RyR、PLC的表达

取3代对数生长期细胞，以1×105/孔的密度接种于6孔板中，随机分为空白组、对照组、药物组(20%，12 h)，每组3个复孔。按照Protein Extraction Kit说明书操作，提取细胞总蛋白。BCA法蛋白定量，100 ℃×10 min蛋白变性。取50μg样品进行电泳，转膜，4℃过夜。按说明书加入一抗、二抗，加入ECL显色液，避光反应1 min，暗室曝光、显影并定影。以β-actin为内参照。各条带灰度值采用Quantity One V.4.6.2软件进行分析，目的蛋白/β-actin即为该蛋白的相对表达量。比较药物组与对照组三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-triphosphate receptors,IP3R)、兰尼碱受体(ryanodine receptor,RyR)、磷脂酶C(phospholipases C,PLC)蛋白表达差异。

1.8 实时荧光定量PCR法检测钙离子通道蛋白IP3R、RyR、PLC mRNA的表达

收集细胞，按照Total RNA Extraction Kit说明书提取总RNA，并电泳检测完整性。根据mRNA cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，cDNA -20℃保存。按照mRNA/lncRNA qPCR Kit说明书进行扩增，扩增程序为：95℃ 30秒，(95℃ 5秒，60℃ 30秒)×45个循环, 以β-actin为内参，所得CT值按照2-△△CT的方法进行均一化处理后再进行统计学分析。比较药物组与对照组IP3R、RyR、PLC mRNA表达差异。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各浓度半夏泻心汤药物血清对ICC表型维持的影响

在激光共聚焦显微镜下，c-kit免疫荧光染色阳性细胞呈绿色，主要集中于细胞膜上。α-SMA、desmin和SMMHC阳性反应呈现红色，主要构成平滑肌细胞骨架(见图1～3)。空白组和对照组相比，ICC c-kit、α-SMA、desmin和SMMHC表达无差异(P>0.05)，即去离子水药物血清对ICC表型维持无影响。

图1 c-kit/α-SMA免疫荧光双标记图

从用药浓度上分析，与对照组比较，中浓度组与高浓度组 c-kit阳性表达显著增加，同时α-SMA阳性表达减少，有统计学差异(P<0.05)，高浓度组α-SMA表达下降明显(P<0.01)且SMMHC表达、desmin表达无统计学差异(P>0.05)。与高浓度组比较，中浓度组SMMHC表达和desmin表达明显表达增加，有统计学差异(P<0.05)，说明ICC平滑肌型增多。故高浓度组ICC表型维持明显，即20%半夏泻心汤全方的SD大鼠含药血清培养有利于ICC表型维持。见表2。

表2 各浓度半夏泻心汤药物血清对ICC c-kit/α-SMA、c-kit/desmin和c-kit/SMMHC表达的影响(平均灰度值,

图2 c-kit/desmin免疫荧光双标记

图3 c-kit/SMMHC免疫荧光双标记图

从处理时间分析，与24小时组、48小时组比较，12小时组c-kit阳性表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，α-SMA、desmin和SMMHC表达有减少趋势。与48小时组比较，12小时组α-SMA平均灰度值明显降低(P<0.05)。与24小时相比，12小时组α-SMA、desmin和SMMHC平均灰度值差异无统计学意义(P>0.05)。综上，12小时组ICC表型明显维持，即药物干预后，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养12小时有利于ICC表型的维持。见表3。

表3 各处理时间对ICC c-kit/α-SMA、c-kit/desmin和c-kit/SMMHC表达的影响(平均灰度值,

2.2 各组小鼠Cajal间质细胞钙离子通道IP3R、RyR、PLC蛋白表达的比较

与空白组相比，对照组IP3R、PLC与空白相比无明显变化(P>0.05)，差异没有统计学意义，RyR表达升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与空白组相比，药物组IP3R、RyR、PLC的蛋白表达均显著升高(P<0.05)，差异有统计学意义。与对照组比较，药物组IP3R、RyR、PLC的蛋白表达均显著升高(P<0.05)，差异具有统计学意义。见图4、表4。

表4 各组小鼠cajal间质细胞钙离子通道IP3R、RyR、PLC蛋白表达的比较

图4 各组小鼠cajal间质细胞钙离子通道IP3R、RyR、PLC蛋白表达的比较

2.3 各组小鼠Cajal间质细胞ICC钙离子通道IP3R、RyR、PLC mRNA表达的比较

与空白组相比， IP3R mRNA、RyR mRNA、PLC mRNA表达无明显差异(P>0.05)，与空白组相比，药物组IP3R mRNA、RyR mRNA、PLC mRNA的表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，药物组IP3R mRNA、RyR mRNA、PLC mRNA表达均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组小鼠cajal间质细胞ICC钙离子通道IP3R、RyR、PLC mRNA表达的比较

3 讨论

ICC普遍分布于胃肠道，与肠神经系统和平滑肌形成网络结构，对起搏功能至关重要。c-kit信号传导对ICC表型维持至关重要，当c-kit被阻断时，ICC不发生细胞凋亡，而开始分化，可分化为平滑肌表型[7-8]。有研究发现，原位及新分离培养的ICC不表达肌球蛋白，但在培养过程中逐渐表达，呈平滑肌表型[9]。α-肌动蛋白(smooth muscle α-actin，α-SMA)和平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain，SMMHC)主要分布于较成熟的平滑肌细胞中，反映平滑肌细胞的收缩能力的强弱，其中，α-SMA在未分化的平滑肌细胞(smooth muscle cells，SMC)中含量极少，而在分化状态的SMC中呈大量表达，且在分化早期表达，其含量增高是SMC分化成熟的标志[10]。desmin是一种在肌细胞细胞骨架的中间细丝中发现的蛋白质[11]，最早表达于未分化的肌母细胞中的肌源性蛋白，是肌分化的早期标志，但有些SMC不含有desmin[12]。从平滑肌相关蛋白的表达，可推测细胞是否产生表型的转化。本研究经免疫荧光双染发现，以高浓度药物血清干预12小时的的ICC表型维持明显(P<0.05)，ICC c-kit 阳性表达显著增加，c-kit/α-SMA阳性表达明显减少，推测半夏泻心汤可增强ICC表型的维持，减少ICC向平滑肌的转化。

ICC Ca2+调节的机制是胃肠运动模式的基础，其慢波的形成依就于ICC中Ca2+激活的Cl-通道(ANO1)的激活[13]。Ca2+瞬变是由细胞内储存的Ca2+释放引起的，并且依赖于RyR(兰尼碱受体)以及来自IP3受体的扩增。最开始由细胞外配体与胞膜酪氨酸激酶受体结合，PLC(激活磷脂酶 C)产生IP3，结合内质网IP3R，IP3R被认为是负责通过细胞内Ca2+释放产生自发内向电流的关键受体[14]。在钙储存中除了IP3R，还有一个主要受体RyR，它们的结构和功能比较相似。而RyR敏感的钙库在胞质内Ca2+浓度升高的条件下，引发Ca2+的释放,这时RyR即随着钙库钙的释放，打开细胞膜上操纵Ca2+的通道，引起Ca2+内流，促进细胞外Ca2+向细胞内转移[15]。有实验研究了IP3R、RyR、PLC受抑制会降低钙震荡的频率。其中，IP3R受体表达被抑制的小鼠不表现出慢波活动[16-17]。钙离子通道蛋白对细胞增殖、凋亡、表型维持有强烈调控作用，ICC表型的维持依赖于细胞内复杂的动态调节。有研究发现，钙离子相关通道可维持主动脉平滑肌细胞，抑制其向成骨或成软骨细胞转化[18]。本实验经Western Blot法、RT-PCR法，从蛋白和基因表达角度，证明半夏泻心汤可增强钙离子通道相关蛋白IP3R、RyR、PLC的表达。

目前，胃肠动力障碍原因多集中体现于ICC凋亡或表型转化两方面[19]。基于心下痞满与胃肠运动功能紊乱之间的密切联系，半夏泻心汤为治疗“心下痞”的经典方剂，可较好调节胃肠道的运动能力。本研究证明，半夏泻心汤可显著增强ICC的表型维持，加强c-kit表达，其机理可能是通过调节钙库受体蛋白IP3R、RyR、PLC表达水平，影响相关离子通道，以产生节律性收缩，促使胃肠道动力恢复正常。这种机制可能是该方调节胃肠运动、治疗“心下痞”的机制之一。