miR-205-5p靶向CDKN1C调节滋养层细胞生物学行为的研究

曹文超,张青林

(首都医科大学附属北京妇产医院麻醉科,北京 100026;*通讯作者,E-mail:qinglinzhanglynn@163.com)

子痫前期(preeclampsia,PE)是一种妊娠期妇女特有疾病,以血压升高和蛋白尿为特征,该病对孕妇及胎儿危害较大,严重时甚至危及生命[1]。研究表明,滋养层细胞侵入过浅以及胎盘蜕膜部位血管发育障碍进而导致的胎盘缺血缺氧是引起PE的重要原因[2]。PE发生后,滋养层细胞侵袭、增殖能力下降且过度凋亡[3,4]。目前,滋养层细胞一直是探究PE发病的热点与重点,因此,探究滋养层细胞生物学行为的变化对于明确PE发病的具体机制具有重要意义。

当前研究发现,在PE发病中,多种microRNA的表达发生改变[5,6]。Mouillet等[7]研究发现,miR-205在缺氧条件下的滋养层细胞中表达增强,但其具体如何参与PE发病和对滋养层细胞是否有影响目前尚未明确。细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子1C(cyclin-dependent kinase inhibitor 1C,CDKN1C)也被称为P57KIP2,其能够抑制大多数CDK-cyclin激酶活性,以往研究证实其在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等癌症中表达下调[8-10]。刘广钰等[11]研究发现过表达P57KIP2使滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显增强。本研究从滋养层细胞生物学行为改变的角度出发,探讨miR-205-5p靶向CDKN1C在调节滋养层细胞中的作用,进而发现参与PE的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HTR8-SVneoh购自美国ATCC细胞库;DMEM/F12培养基(PM150110)、胎牛血清(SFBS)均购自上海语纯生物科技有限公司;lipofectamin2000试剂盒(11668027)、Trizol试剂(15596026)、细胞裂解液(78501)均购自Thermo Fisher公司;双荧光素酶报告基因试剂盒(ab228530),一抗CDKN1C(ab75974)、Bax(ab32053)、Bcl-2(ab185002)、TGF-β1(ab92486)、Vimentin(ab92547)、N-cadherin(ab18203)、E-cadherin(ab194982),二抗山羊抗兔IgG(ab6721)均购自Abcam公司;焦炭酸二乙酯(1609-47-8)购自上海信裕生物科技有限公司;逆转录试剂盒(BPI01030)购自北京华大蛋白质研发中心有限公司;qRT-PCR试剂盒(QP015)购自艾美捷科技有限公司;BCA试剂盒(P0010)购自碧云天生物技术研究所;SDS凝胶(P1200-25T)购自北京索莱宝;多聚甲醛(30525-89-4)购自南京化学试剂股份有限公司;碘化丙啶(25535-16-4)购自上海颖心实验室设备有限公司;紫外/可见光分光光度计(SP-3803AA)购自上海光谱仪器有限公司;酶标仪(HBS-1096B)购自南京德铁实验设备有限公司;倒置显微镜(MX62)购自奥林巴斯;流式细胞仪(CytoFLEX)购自Beckman公司。

1.2 细胞培养及分组转染

人类滋养层细胞系HTR8-SVneo置于DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清)中并在37 ℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中进行培养3 d。取对数生长的HTR8-SVneo细胞按密度3×105/ml接种于96孔板中。将细胞分为下列几组:NC组(negative control,转染阴性对照序列)、miR-205-5p mimic组(转染miR-205-5p mimic)、miR-205-5p inhibitor组(转染miR-205-5p inhibitor)、CDKN1C组(转染CDKN1C过表达重组质粒)、miR-205-5p mimic+CDKN1C组(共同转染miR-205-5p mimic和CDKN1C过表达重组质粒),按照lipofectamin2000试剂盒说明书对细胞进行转染。

1.3 双荧光素酶报告实验验证miR-205-5p与CDKN1C的靶向关系

通过靶向关系网站miR WALK(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)验证CDKN1C与miR-205-5p存在结合位点,然后通过双荧光素酶报告验证CDKN1C与miR-205-5p之间的靶向关系。实验步骤依据双荧光素酶试剂盒说明书进行,之后检测荧光素酶活性。

1.4 qRT-PCR检测目的因子的mRNA表达水平

在各组细胞中加入Trizol试剂对总RNA进行提取,加入焦炭酸二乙酯水对总RNA充分溶解后,采用紫外/可见光分光光度计测定260 nm与280 nm下的吸光度值,鉴定RNA的质量及浓度。借助逆转录试剂盒合成cDNA,cDNA通过85 ℃温浴灭活逆转录酶3 min后,依据试剂盒说明书进行后续PCR反应。miR-205-5p的相对表达水平以U6作为内参,其余因子以GAPDH作为内参。2-ΔΔCt法测定RNA表达量。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Western blot检测细胞中各因子蛋白表达水平

在细胞中加入冰上预冷的细胞裂解液裂解30 min后,用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品在100 ℃水浴变性3 min,上样,行SDS-凝胶电泳,湿转法转移到PVDF膜上,将含5%脱脂奶粉的TBST的放于PVDF膜上封闭1 h。弃封闭液,加入一抗CDKN1C(1 ∶1 000)Bax(1 ∶1 500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、TGF-β1(1 ∶1 000)、Vimentin(1 ∶1 500)、N-cadherin(1 ∶1 500)及E-cadherin(1 ∶1 500)后于冰箱过夜,将一抗与封闭液倒掉,TBST漂洗3次,加入二抗山羊抗兔IgG(1 ∶1 000),室温孵育1 h,TBST漂洗3次。通过ECL进行显影,Image J软件检测蛋白条带的表达。

1.6 MTT检测细胞增殖能力

取对数生长期细胞进行胰酶消化,将细胞悬液以104个/孔接种于96孔板中,将其放在5% CO2、37 ℃环境下进行孵育。当细胞培养24,48,72 h后每孔加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml),继续培养4 h后终止培养,去培养液。使用酶标仪测量570 nm处各孔OD值。

1.7 Transwell检测细胞侵袭情况

将完全培养基(含10%胎牛血清)置于Transwell小室的下室,收集重悬好的细胞液加入Transwell小室的上室(100 μl/室),在5% CO2、37 ℃条件下培养24 h后取出Transwell小室,擦去上室上层细胞,多聚甲醛固定,结晶紫染色。借助倒置显微镜随机选取5个视野观察穿膜细胞数并拍照。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡情况

取对数生长期的细胞,在4 ℃条件下离心、弃上清后,将细胞浓度调整至1×106/ml,以2 ml每孔接种于96孔板上,用Anexin Ⅴ-FITC染液进行避光染色20 min,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 miR-205-5p靶向抑制CDKN1C的表达

靶向关系网站miR WALK发现miR-205-5p与CDKN1C存在结合位点(见图1A),双荧光素酶报告实验结果显示,miR-205-5p mimic显著抑制CDKN1C-3′UTR-WT的荧光素酶活性(P<0.05,见图1B);对CDKN1C-3′UTR-MUT的荧光素酶活性没有明显影响。

图1 miR-205-5p与CDKN1C靶向关系验证Figure 1 Verification of the targeting relationship between miR-205-5p and CDKN1C

2.2 抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C促进滋养层细胞增殖

MTT检测结果发现:相对于NC组,miR-205-5p inhibitor组和CDKN1C组中细胞增殖活力显著增强(均P<0.05);miR-205-5p mimic组中细胞增殖活力显著下降(P<0.05);miR-205-5p mimic+CDKN1C组中细胞增殖活力变化不显著(P>0.05,见图2)。

2.3 抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C促进滋养层细胞凋亡

流式细胞术检测细胞凋亡情况发现:相较于NC组,miR-205-5p inhibitor组和CDKN1C组中细胞凋亡降低(均P<0.05);miR-205-5p mimic组中细胞凋亡显著增加(P<0.05,见图3)。

与NC组相比,*P<0.05;与miR-205-5p mimic+CDKN1C组比较,#P<0.05图2 抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C对细胞增殖活力的影响Figure 2 Effect of miR-205-5p inhibitoror CDKN1C overexpression oncell proliferation activity

与NC组比较,*P<0.05;与miR-205-5p mimic+CDKN1C组比较,#P<0.05图3 抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C对细胞凋亡的影响Figure 3 Effect of miR-205-5p inhibitor or CDKN1C overexpression on cell apoptosis

2.4 抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C后Bcl-2、TGF-β1表达上升,Bax表达下降

qRT-PCR与Western blot检测显示:与NC组相比,miR-205-5p inhibitor组和CDKN1C组中CDKN1C、Bcl-2、TGF-β1表达上升,Bax表达下降;miR-205-5p mimic组中CDKN1C、Bcl-2、TGF-β1表达显著降低,Bax表达显著升高(均P<0.05,见图4)。miR-205-5p mimic+CDKN1C组中各项指标与NC组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

2.5 抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C促进滋养层细胞侵袭

Transwell检测细胞侵袭结果显示:与NC组比较,miR-205-5p inhibitor组和CDKN1C组中细胞侵袭数目增多(均P<0.05);miR-205-5p mimic组中细胞侵袭数目减少(均P<0.05,见图5)。miR-205-5p mimic+CDKN1C组中细胞侵袭与NC组差异不显著(均P>0.05)。

与NC组相比,*P<0.05;与miR-205-5p mimic+CDKN1C组比较,#P<0.05图4 qRT-PCR和Western blot检测抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C后Bcl-2,TGF-β1,Bax的变化Figure 4 Expression of Bcl-2,TGF-β1,Bax aftertreatment with miR-205-5p inhibitor or CDKN1C overexpressionby qRT-PCR and Western blot

与NC组相比,*P<0.05;与miR-205-5p mimic+CDKN1C组比较,#P<0.05图5 抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C对细胞侵袭能力的影响 (×100)Figure 5 Effect of miR-205-5p inhibitor or CDKN1C overexpression on cell invasion ability (×100)

2.6 抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C促进HTR-8/SVneo细胞系上皮间质转化

Western blot检测各组细胞上皮间质转化因子Vimentin、N-cadherin及E-cadherin的表达发现:相较于NC组,miR-205-5p inhibitor组与CDKN1C组中Vimentin、N-cadherin表达上升,E-cadherin表达下降;miR-205-5p mimic组中Vimentin、N-cadherin表达显著增加,E-cadherin表达显著降低(均P<0.05,见图6)。miR-205-5p mimic+CDKN1C组与NC组中各项指标差异无统计学意义(均P>0.05)。

与NC组相比,*P<0.05;与miR-205-5p mimic+CDKN1C组比较,#P<0.05图6 Western blot检测抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C后上皮间质转化相关蛋白的表达Figure 6 Effect of miR-205-5p inhibitor or CDKN1C overexpression onexpression of proteins related to epithelial-mesenchymal transition by Werstern blot

3 讨论

PE作为胎盘源性疾病,发病机制较为复杂,相关临床和实验研究发现,胎盘中滋养层细胞侵入不足是PE发病的中心环节[12]。因此,促进滋养层细胞的增殖、侵袭,减少其凋亡对治疗PE是十分重要的。本研究通过探究miR-205-5p在PE发病中的作用,寻找治疗PE的潜在靶点。

miRNA参与调控很多重要的细胞生物学过程,包含细胞的增殖、分化、转移、凋亡等[13]。目前,miRNA在PE中的作用越来越受到关注,如许燕滨等[14]研究发现miR-17-5p在PE发病中呈现高表达;另外也有研究证实,过表达miR-16能够促进PE中间充质干细胞的凋亡并减少滋养层细胞的侵袭[15]。miR-205-5p在PE中的作用目前尚未明确,只是有相关研究揭示miR-205在缺氧条件下损伤滋养层细胞[7]。在探究miR-205的作用时,大部分文献资料集中在肿瘤生物学领域,研究表明,过表达miR-205能够抑制肿瘤细胞中生长、增殖、迁移[16,17]。而滋养层细胞是一种具有高增殖特点的细胞,与肿瘤细胞生物学特性类似,本研究通过相关实验证实过表达miR-205-5p能够抑制滋养层细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡。

人类印记基因的表达主要是在胎盘中,调控胎盘与胎儿生长及发育[18]。CDKN1C作为一种母源表达、父源印记的印记基因,促进细胞的分化,其表达影响女性的整个妊娠期,相关研究发现其在PE患者胎盘中表达降低[19,20]。本研究通过双荧光素酶报告实验证实,CDKN1C是miR-205-5p的靶基因。TGF-β1是调节细胞生长和分化的重要因子,影响妊娠期女性胎盘的发育及功能作用,此外TGF-β1能够促进人滋养层细胞的分化[21,22]。本研究通过检测各组滋养层细胞相关因子发现,抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C后,Bcl-2、TGF-β1表达上升,Bax表达下降;细胞的增殖活力与侵袭能力增强;细胞的凋亡率下降。过表达miR-205-5p则变化与之相反,同时miR-205-5p的作用能够被过表达CDKN1C所挽救。这进一步证明抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C能在滋养层细胞中起保护作用。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞转化为具有增殖、迁移能力的间质细胞的过程,伴随上皮细胞的标志物(E-cadherin、Cytokeratin)的丧失,间质细胞标志物(Vimentin、N-cadherin)表达[23,24]。滋养层细胞的浸润机制与EMT过程密切相关,EMT过程受阻会造成胎盘功能障碍进而诱发PE[25]。本研究通过抑制miR-205-5p或过表达CDKN1C实验发现,E-cadherin表达下降,Vimentin、N-cadherin表达上升,从而促进EMT的发生,进而影响滋养层细胞的增殖和侵袭。

综上所述,抑制miR-205-5p的表达能够促进CDKN1C表达,提高滋养层细胞的增殖、侵袭能力,促进EMT的发生。因此,miR-205-5p可能参与PE的发病,有望成为治疗PE的关键靶点。