β2AR激动剂通过线粒体细胞凋亡途径改善大鼠心肌缺血再灌注损伤

刘 通,史静怡,王 利,闫泱锦,程 康,冀永春

(西安市第三医院,西北大学附属医院心血管内科,西安 710018;*通讯作者,E-mail:18629057123@163.com)

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)属于冠心病的一种特殊类型,是指由冠状动脉粥样硬化而引起长期心肌缺血,导致患者心肌弥漫性纤维化,产生与原发性扩张型心肌病类似的临床综合征[1],其是严重危胁人类健康的主要疾病之一[2]。随着冠心病发病率的不断增加,ICM对人类健康所造成的危害也日渐严重。目前对其治疗主要是及时有效的恢复血流,抢救“濒死”的心肌[3]。但是,再灌注过程会对心肌造成一定的损伤,这种损伤被称为心肌缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/R),该损伤因严重影响心肌梗死再灌注治疗的效果而逐渐成为研究重点[4]。研究表明,细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用。细胞凋亡中3条主要途径(线粒体、死亡受体及内质网)中线粒体途径为细胞凋亡的关键环节。近年来,通过调节线粒体通路抑制心肌细胞凋亡是研究心肌缺血损伤的一大重点[5]。β2肾上腺素受体(β2-adrenergic receptors,β2AR)在I/R中具有重要的作用[6]。研究发现,在心肌缺血时,过度激动β2AR,导致心脏氧耗增多,最终导致心肌细胞坏死,激动β1受体促进凋亡,而激动β2受体有抗凋亡作用[7]。Clenbuterol是选择性β2受体激动剂,张秋芳等[8]发现在心梗后长期联合应用β2肾上腺受体阻断剂clenbuterol可提高生存率,对心肌细胞有保护作用。由此,我们推测clenbuterol可能通过激动β2受体对I/R损伤具有保护作用,且主要是通过线粒体细胞凋亡途径发挥作用。因此本研究通过建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型在整体和细胞水平研究β2肾上腺素能受体激动剂(clenbuterol)对I/R中线粒体细胞凋亡途径的影响,以期为冠心病的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

戊巴比妥钠(Sigma,USA),TTC(Sigma-Aldrich),RNA提取试剂盒(Invitrogen,USA)RT-PCR试剂盒(Fermetas),线粒体蛋白提取试剂盒(wla034a)、BCA蛋白定量试剂盒(wla004a),ELISA试剂盒(Sigma Aldrich),LDH和CK-MB(南京建成生物工程研究所),抗体AR-β2(Abcam)、Bax(Abcam)、Caspase-3(Abcam)、Cx43(Abcam)和PKC-ε(Abcam),电压依赖性阴离子通道蛋白1(voltage-dependent anion channel protein 1,VDAC1)兔抗大鼠多克隆抗体(沈阳万类,wl02790)。

1.2 实验方法

1.2.1 急性心肌缺血再灌注损伤大鼠模型的制备与分组 45只体质量为250-300 g的成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠购自兵器工业卫生研究所[SCXK(陕)2016-001],随机分为假手术组、模型组和实验组,每组15只。大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠(1.5 ml/kg)麻醉后,进行气管插管,调节呼吸频率为90次/min,潮气量11 ml/kg,连接心电监护仪,于大鼠胸骨左侧第3、4肋间做手术切口,暴露心脏,剥离心包膜,采用7-0带线缝合针于左心耳下缘1 cm处穿过待结扎加压。假手术组大鼠不结扎加压,仅在假手术开始前通过腹腔注射给予生理盐水(4 ml/kg);模型组大鼠在结扎前通过腹腔注射给予生理盐水(4 ml/kg)并开始计时,观察到心电图ST段持续弓背抬高,确定心肌缺血成功,30 min后轻抽鱼线再灌注3 h[9]。实验组大鼠在结扎前5 min通过腹腔注射给予clenbuterol(0.5 mg/kg),后续处理同模型组。再灌注结束后收集大鼠心脏和血液,进行相关指标检测。

1.2.2 指标观察与组织学检查 通过测量Ⅱ导联心电图同步监测所有组别大鼠结扎30 min后的心电图表现,并与术前心电图比较,观察大鼠心电图有无再灌注心律失常现象。取各组大鼠左室心尖部组织进行多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,再经过二甲苯脱蜡,经无水乙醇、95%乙醇和80%乙醇逐级漂洗,行苏木素一伊红(HE)染色,于光学显微镜下观察。

1.2.3 线粒体超微结构观察 大鼠造模结束取血后迅速剪下心脏,以生理盐水灌洗后在冰上分离左心室,取一小块组织置入2.5%戊二醛固定液中,并在固定液中迅速将其剪为体积约1 mm3的小块,经过脱水、渗透、包埋聚合、切片等步骤,于透射电镜下找到心肌细胞内的线粒体进行观察并拍照。

1.2.4 心肌酶检测 造模结束后剪开颈部皮肤,分离颈静脉并以一次性医用取血管取血。血液静置30 min后置入离心机,以3 000 r/min离心10 min,血清移入EP管中,应用全自动生化分析仪测定各组血清中肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量。

1.2.5 RNA提取和RT-PCR检测 通过Trizol法从大鼠心肌组织细胞中提取总RNA,然后将纯化的RNA反转录为cDNA。再通过RT-PCR试剂盒定量检测β2AR的mRNA表达水平。使用Thermo Fisher的Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪器进行检测,采用的软件为Mx3000P,PCR程序为:95 ℃预热10 min,95 ℃ 15 s,55 ℃退火1 min,40个循环反应。引物序列:β2AR,F:5′-CAGCAAAGGGACGAGGTG-3′,R:5′-AAGTAATGGCAAAGTAGCG-3′;GAPDH,F:5′-CGTGCGTGACATTAAGGAG-3′,R:5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3′。GAPDH作为内参,通过2-ΔΔCt方法检测基因相对表达水平。

1.2.6 蛋白质免疫印迹分析 用RIPA法从大鼠心肌组织细胞中提取总蛋白,以线粒体蛋白提取试剂盒提取线粒体蛋白,于4 ℃ 10 000g离心5 min。BCA测定法测量蛋白质含量,用8%-12% SDS-PAGE分离蛋白质样品(50 μg),并转移到硝酸纤维素膜上。然后将膜用TBST中的5% BSA封闭,并与β2AR(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Caspase-3(1 ∶1 000)、Cx43(1 ∶1 000)、PKC-ε(1 ∶500)和电压依赖性阴离子通道蛋白1(VDAC1)兔抗大鼠多克隆抗体(1 ∶1 000)第一抗体在4 ℃下孵育过夜,然后将膜用TBST洗涤,并与HRP偶联的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)或HRP偶联的山羊抗小鼠抗体在37 ℃孵育1 h。使用ECL蛋白质印迹检测试剂观察蛋白质条带,并计算灰度值。

1.3 数据处理与统计分析

使用SPSS21.0分析数据,所有数据表示为平均值±标准差,两组数据采用t检验比较差异性,多组数据采用单因素方差分析差异性。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 模型组大鼠心电图变化

模型组大鼠结扎后,ST段显著上移,T波增高,表现出心律失常现象,而再灌注之后,ST段和T波与结扎时相比显著下降,但与结扎前相比仍有增加(P<0.01,见表1),表明心肌缺血再灌注大鼠模型构建成功。

表1 模型组大鼠心肌缺血再灌注前后心电图的变化 (mV)

2.2 β2肾上腺素能受体激动剂对大鼠心肌组织的病理改变影响

HE染色结果表明,假手术组大鼠心肌细胞形态无变化,皮质神经元显示正常结构;模型组大鼠核固缩,核周体显著增加,出现众多的空泡空间;与模型组相比,实验组心肌细胞坏死明显减少,心肌纤维可见轻度水肿,可见核的残留神经元的结构得到改善(见图1)。

2.3 大鼠心肌细胞线粒体超微结构观察

透射电镜下可见,假手术组大鼠神经元和细胞器的外观形态正常,线粒体形态和大小正常;模型组大鼠线粒体肿胀、变形严重,膜结构模糊;实验组大鼠膜结构模糊,线粒体略有肿胀,神经元损伤较轻(见图2)。该结果提示β2肾上腺素能受体激动剂clenbuterol可以有效减轻大鼠心肌缺血再灌注造成的线粒体超微结构的损伤。

2.4 大鼠心肌组织中β2AR的表达

与模型组相比,实验组大鼠心肌组织中β2AR的mRNA和蛋白相对表达量显著上调(P<0.05,见图3)。表明β2肾上腺素能受体激动剂clenbuterol能够激活β2AR的表达。

图1 大鼠心肌组织HE染色结果 (×200)Figure 1 HE staining results of rat myocardial tissue (×200)

图2 肾上腺素能受体激动剂clenbuterol对大鼠心肌缺血再灌注后线粒体超微结构的影响 (×2 000)Figure 2 Effect of clenbuterol on ultrastructure of mitochondria after myocardial ischemia-reperfusion injury in rats (×2 000)

A.各组大鼠中β2AR mRNA的相对表达水平 B.各组大鼠中β2AR蛋白的相对表达水平与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05图3 肾上腺素能受体激动剂clenbuterol对大鼠心肌组织中β2AR的mRNA和蛋白表达的影响Figure 3 Effect of clenbuterol on β2AR mRNA and protein expression in myocardial tissues in each group

2.5 大鼠血清中心肌酶检测分析

与假手术组比较,模型组和实验组大鼠血清中CK-MB和LDH含量显著升高(P<0.05);与模型组比较,实验组大鼠血清中CK-MB和LDH含量显著降低(P<0.05,见图4)。提示β2肾上腺素能受体激动剂clenbuterol能显著降低大鼠心肌缺血再灌注导致的急性心肌损伤。

与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05图4 肾上腺素能受体激动剂clenbuterol对大鼠心肌缺血再灌注后血清中心肌酶水平的影响Figure 4 Effect of clenbuterol on serum myocardial enzyme level after myocardial ischemia-reperfusion in rats

2.6 大鼠心肌细胞凋亡因子与线粒体蛋白表达分析

与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bax和Caspase-3蛋白表达水平显著上调(P<0.05);与模型组比较,实验组大鼠心肌组织中Bax和Caspase-3蛋白表达水平显著下调(P<0.05,见图5)。与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Cx43和PKC-ε蛋白表达水平明显下调(P<0.05);与模型组比较,实验组大鼠心肌组织中Cx43和PKC-ε蛋白表达水平显著上调(P<0.05,见图5)。提示β2肾上腺素能受体激动剂clenbuterol在大鼠心肌缺血再灌注过程中可能通过上调Cx43和PKC-ε蛋白表达而抑制线粒体细胞的凋亡。

与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05图5 肾上腺素能受体激动剂clenbuterol对大鼠心肌细胞凋亡因子与线粒体蛋白表达的影响Figure 5 Effect of clenbuterol on the expression levels of rat cardiomyocyte apoptosis factors and mitochondrial proteins

3 讨论

心肌缺血对心肌产生一定损伤,目前常见的治疗方式为再灌注,但是再灌注过程可进一步加重心肌的损伤,从而引起一系列病症[10],因此通过不同治疗缓解损伤是目前研究的重点。而相关研究主要是通过建立大鼠缺血再灌损伤模型实现,主要是由于具有大鼠冠状动脉分支少、用于制备缺血再灌损伤模型复制性好、模型成功率高等优势[11]。本实验构建大鼠心肌缺血再灌注模型,发现β2肾上腺素能受体激动剂clenbuterol可明显降低心肌缺血损伤症状,且发现这种治疗作用上调了β2AR基因表达,缓解了线粒体损伤以及调控线粒体内蛋白Cx43、PKC-ε以及细胞凋亡因子Caspase-3和Bax的表达,因此推测clenbuterol治疗作用可能主要是通过抑制线粒体细胞凋亡实现。

LDH和CK-MB是细胞损伤程度的标志[12],其存在于心肌细胞内,只有当细胞膜受损,通透性发生改变时才会出现外漏,所以通常检测和来评价细胞损伤的程度[13]。本实验结果表明,clenbuterol可降低心肌缺血再灌后造成的心肌损伤,即与模型组相比,clenbuterol治疗可显著降低大鼠血清中LDH和CK-MB的释放量,这说明clenbuterol对缺血再灌注后的心肌细胞有保护作用,这与前人的报道一致[8]。

心肌细胞在缺血缺氧条件下会发生线粒体功能障碍[14]、线粒体内的细胞色素C释放进入胞质并启动线粒体凋亡途径[15]。本研究通过透射电镜观察各组中线粒体情况,结果发现,clenbuterol能缓解线粒体损伤,这与前人结果一致。Bax是线粒体膜上调节细胞色素C通透性的分子[16],其主要通过增加细胞色素C的释放并起到促凋亡作用[17],进入胞质的细胞色素C通过级联反应来激活Caspase-3并引起细胞凋亡[18],本实验中,模型组中Bax和Caspase-3的表达水平均明显高于假手术组,提示心肌缺血再灌注能够导致心肌细胞的线粒体凋亡途径发生激活。而实验组大鼠心肌组织中Bax和Caspase-3的表达水平均明显低于模型组。另外,研究表明,线粒体Cx43及PKC-ε在调节心肌细胞内ATP敏感性钾通道及MitoKATP通道中起着重要作用[19],其中MitoKATP通道在干预心肌缺血再灌注损伤中起关键作用[20],因此,本实验检测了线粒体中Cx43及PKC-ε蛋白的表达量,结果发现,clenbuterol显著上调了线粒体中Cx43及PKC-ε蛋白的表达量,表明β2肾上腺素能受体激动剂clenbuterol能够抑制心肌缺血再灌注引起的心肌细胞线粒体途径凋亡。

综上所述,β2肾上腺素能受体激动剂clenbuterol能够减轻心肌缺血再灌注诱导的心肌细胞损害、抑制再灌注诱导的心肌细胞线粒体途径凋亡,且这种抑制主要是通过上调线粒体中Cx43及PKC-ε蛋白以及抑制细胞凋亡因子Bax和Caspase-3的表达来发挥作用。