和厚朴酚对PM2.5诱导的人肺内皮细胞炎症损伤的保护效应

2021-01-21马敏杰王凤至李淑珍

临床医药文献杂志(电子版) 2020年82期

马敏杰，邓航，王凤至，王君，李淑珍*

（1.沈阳医学院基础医学院，辽宁沈阳 110034；2. 沈阳医学院口腔医学院，辽宁沈阳 110034）

空气污染物中的细颗粒物（直径＜2.5μm，PM2.5），由于直径小，吸入后，可直达细支气管和肺泡，并且基本不可被代谢排出，对机体危害极大。已证实PM2.5吸入与多种呼吸和心血管系统疾病的发生发展有关[1]。可通过激活多条氧化应激途径，导致支气管上皮和肺内皮损伤，介导炎症的发生[2]。

和厚朴酚可从厚朴的干皮和根枝皮中分离得到，属酚类化合物。已证实，和厚朴酚具有广泛的抗炎、抗氧化和降血脂等作用[3]。但尚未见到和厚朴酚具有抗PM2.5诱导的细胞损伤作用。本研究旨在探讨和厚朴酚对PM2.5诱导的HPAECs炎症损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 PM2.5样品收集与制备

以沈阳市沈阳医学院校门口为采样地点，利用高流量样品颗粒物采集器，收集2019年10-12月期间的空气中的污染物颗粒于硝酸纤维素膜上。待滤膜变黑后，置于-80℃冰箱保存备用。

将滤膜裁剪成1cm2大小后，浸泡于预冷的30ml超纯水中，超声振荡45min，并灭菌，真空冻干，备用。

1.2 HPAECs培养

将HPAECs置于内皮细胞培养液（ECM）中，细胞孵箱培养，待细胞达到生长对数期后，更换为无血清DMEM培养液，饥饿6h后，进行细胞实验。

1.3 cck-8方法检测细胞活力

取饥饿后的HPAECs，50μg/ml PM2.5混悬液孵育6h后，加入终浓度为12.5、25、50和100μg/ml和厚朴酚分别作用6，12，24和48h。加入cck-8探针，避光孵育1h，于480nm波长处检测OD值。

1.4 ELISA方法检测炎症因子含量

前处理同cck-8，收集培养液，离心15min，收集上清液，试剂盒检测IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α的含量变化。

1.5 Real-time PCR检测IL-6和STAT3的表达

细胞孵育结束后，弃去培养液，并加入1ml Trizol，反复吹吸后，收集提取液，标准三步法提取细胞RNA，并逆转录成cDNA，进行Real-time PCR实验。检测IL-6和STAT3基因的表达，采用2-ΔΔCt方法分析IL-6和STAT3基因的相对表达量。

1.6 Western blot检测炎症相关蛋白的表达

细胞培养和孵育同上，而后1×PBS清洗细胞3次，加入RIPA裂解液，收集细胞蛋白裂解液。按照Western blot标准步骤操作。收集目的条带，Image J软件灰度分析，β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学分析

数据以均数±标准差表示，两组间比较使用t检验，多组间比较使用one-way ANOVA，当P＜0.05时，认为有统计学差异。

2 结果

2.1 和厚朴酚增强PM2.5损伤的HPAECs细胞活力

细胞孵育结束后，cck-8法检测各孔OD值。设定正常组细胞活力为100%，计算各组细胞的相对活力。结果显示：PM2.5暴露后可导致HPAECs活力明显下降，而从25μg/ml开始，和厚朴酚可明显增强PM2.5暴露损伤的HPAECs活力，呈时间和剂量依赖性（图1）。

2.2 和厚朴酚降低PM2.5损伤的HPAECs中炎性因子的含量

和厚朴酚和PM2.5共孵育后，ELISA方法测定了炎性因子的含量。结果显示：PM2.5暴露可导致细胞培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明显升高，而50μg/ml和厚朴酚作用后，IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明显降低，但IL-17的含量无明显变化（图2）。

2.3 和厚朴酚调控IL-6和STAT3基因的表达

Real-time PCR方法检测了和厚朴酚和PM2.5共孵育24h后，HPAECs中IL-6和STAT3基因的表达变化。结果显示：与对照组相比，PM2.5暴露可明显提高IL-6和STAT3基因的表达，而50μg/ml和厚朴酚作用后，IL-6和STAT3基因的表达明显降低，说明和厚朴酚在HPAECs中可从基因水平通过调控IL-6/STAT3的表达发挥抗PM2.5诱导的损伤作用（图3）。