维生素C通过胰岛素信号通路增强秀丽隐杆线虫抗氧化作用

傅雯 柏桦 王瑶 李恩霜 钱玉霞 杨娇 邹伟

摘 要：目的：利用秀丽隐杆线虫为模式生物，研究维生素C在秀丽隐杆线虫体内的抗氧化效应及其机制。方法：分别以含有0.05、0.25、0.5 mg/mL维生素C的NGM培养基饲养秀丽隐杆线虫，测定不同浓度维生素C饲养线虫体内超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的含量，同时检测0.25 mg/mL的维生素C饲养线虫age-1、daf-2、daf-16、sir-2.1、clt-1基因mRNA变化。在高氧环境中，干扰0.25 mg/mL维生素C饲养线虫daf-2、daf-16基因表达检测线虫的存活情况，观察0.25 mg/mL维生素C饲养线虫DAF-16入核情况。结果：0.25 mg/mL的维生素C提高秀丽隐杆线虫体内SOD和CAT活力，在高氧环境中，0.25 mg/mL的维生素C降低age-1、daf-2基因表达，提高daf-16基因表达，同时增加DAF-16蛋白入核。结论：维生素C通过DAF-16胰岛素信号通路增强秀丽隐杆线虫抗氧化作用。

关键词：秀丽隐杆线虫;抗氧化作用;维生素C;胰岛素信号途径

及时消除机体内的自由基将会减少人类很多衰老疾病，如糖尿病、老年痴呆症等。维生素C有两种异构体，分别是L型和D型，其中L型抗坏血酸是一种良好的水溶性抗氧化剂，广泛存在于新鲜的蔬菜、水果中，人体自身不能合成需通过进食获取[1-3]。维生素C能维持人体红细胞ATP酶以及超氧化物歧化酶（SOD）活性，在起到降低血浆丙二醛和钾离子含量的作用的同时，也可以清除体内多种有害自由基，包括超氧负离子、羟自由基、有机自由基、有机过氧基等，从而保护机体免受自由基的破坏[4-5]。

近年来研究发现，不同的维生素C浓度对抗氧化作用的调节不同，高浓度的条件下维生素C具有促氧化作用，在细胞外液中产生过氧化氢（H2O2）后进入细胞，加速产生更多的活性氧（ROS）损伤DNA，造成细胞膜功能障碍[6]。适当浓度维生素C对衰老大鼠红细胞的抗氧化能力具有修复作用[7]，不同质量浓度的维生素C可以降低亚硝酸盐对匙吻鲟仔鱼胁迫作用[8]，在一定浓度范围内维生素C可促进维生素D3活化，从而在降低体内的氧化应激水平时可以同步提高机体的抗氧化能力[9]。维生素C在秀丽隐杆线虫体内调节抗氧化的分子机制尚不完善，基于对秀丽隐杆线虫机制的探索操作易行，且其与人类的遗传物质相似，可用于代谢功能研究[10]。因此，以秀丽隐杆线虫为模式生物，测定其体内的抗氧化酶活力、相关基因（age-1、daf-2、daf-16、sir-2.1、clt-1等）的表达水平。其次，在高氧环境中，通过基因干扰的方法探讨维生素C在秀丽隐杆线虫体内抗氧化过程中起的作用及其调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

维生素C，上海生工生物工程有限公司;SOD试剂盒、CAT试剂盒，南京建成生物工程研究所;RNA提取试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司;c-DNA合成试剂盒、SYBR Green，天根生化科技（北京）有限公司;q-PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成;daf-16（ot971[daf-16：GFP]）秀丽隐杆线虫株（以下简称daf-16：GFP秀丽隐杆线虫株），用绿色荧光蛋白将DAF-16蛋白进行荧光标记，由云南大学微生物重点实验室馈赠。

1.2 仪器与设备

倒置荧光显微镜，日本Nikon公司;超声破碎仪，宁波新芝生物科技公司;酶标仪，郑州安图实验仪器有限公司;低温高速离心机，美国贝克曼公司;PCR仪器，德国Biometra公司;电泳仪、凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司;实时荧光定量PCR仪，德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 秀丽隐杆线虫培养 接种线虫于生长培养基（NGM）中，待线虫大量产卵后进行同步化得到虫卵。4 000 r/min离心30 s后收集虫体和虫卵于15 mL离心管中，去上清液，加入次氯酸钠200 μL和5 mol/L氢氧化钠50 μL，边震荡边观察直至虫体破碎，立即加入M9至管中14 mL刻度处，4 000 r/min离心2 min，去上清液。加入M9至管中14 mL刻度处，4 000 r/min离心2 min冲洗4次。留1 mL液体混匀后加入到培养皿中，补充适量的M9。放置于20摄氏度的恒温箱培养12 h，待虫卵孵化，将其加入到新鲜NGM培养基中长至未产卵的成虫阶段备用。

1.3.2 抗氧化酶活力测定 将同步化后L1期线虫分别加入含有0、0.05、0.25、0.5 mg/mL维生素C的NGM平板中培养2 d后，收集至EP管。M9洗涤并加入200 μL生理盐水于超声破碎仪上破碎，取上清液，按照超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）试剂盒的操作步骤测定SOD、CAT活力。实验重复3次。

1.3.3 实时荧光定量PCR 线虫同步化后收集虫卵孵化L1线虫，将L1线虫加至普通NGM平板或维生素C的NGM平板中进行培养，48 h后收集线虫。按照宝生物工程（大连）有限公司的RNA提取试剂盒的步骤提取线虫的总RNA，按照天根生化科技有限公司的逆转录试剂盒的步骤进行逆转錄反应合成c-DNA，并进行实时荧光定量PCR。我们以gpd-1为内参基因，用2-ΔΔCt计算0.25 mg/mL维生素C处理组较之对照组age-1、daf-2、daf-16、sir2.1、clt-1基因转录水平的差异，引物序列见表1。

1.3.4 线虫RNAi干扰 接种HT115菌株、age-1以及daf-16基因干扰株于5 mL含100 μg/mL的氨苄培养基中培养8 h，取300 μL菌液加至含1 mmol/L IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和100 μg/mL AMP的NGM培养基上并吹干，20 ℃恒温箱培养12 h，诱导小RNA的生成。将L1线虫加入成功诱导出小RNA生成的平板中，培养48 h，收集平板上的线虫进行后续实验。

1.3.5 线虫急性氧化应激实验 将野生型线虫、0.25 mg/mL维生素C饲养线虫、0.25 mg/mL维生素C饲养age-1RNAi线虫和0.25 mg/mL维生素C饲养daf-16 RNAi线虫转移到含1‰ H2O2及对应浓度维生素C平板（加入产卵抑制剂FUDR）中，每组3板，每板30条线虫左右。每间隔2 d观察线虫存活情况，直至所有平板有线虫死亡为止，实验重复3次。

1.3.6 线虫荧光观察 将daf-16：GFP L4期线虫和0.25 mg/mL维生素C饲养daf-16：GFP L4期线虫转移到含1‰ H2O2和对应浓度维生素C平板（加入产卵抑制剂FUDR）1 d后，荧光显微镜下观察DAF-16入核情况（n=20），实验重复3次。

1.3.7 数据分析 采用GraphPad软件进行作图和统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，采用卡方检验进行率的比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同浓度维生素C对秀丽隐杆线虫体内SOD和CAT活力的影响

将L1线虫饲养于含0、0.05、0.25、0.5 mg/mL的维生素C NGM平板2 d后，收集未产卵的成虫，分别测定SOD和CAT活力，与对照组相比，0.05 mg/mL维生素C饲养线虫SOD活力无明显增强（P>0.05），将浓度提高至0.25 mg/mL后，SOD活力增强为261.7%（P<0.05），浓度提升至0.5 mg/mL，SOD活力增强为116%（P<0.05）。此外与对照组相比，0.05 mg/mL维生素C饲养线虫CAT活力无明显提升（P>0.05），0.25 mg/mL处理后，CAT活力提升为155.8%（P<0.05），浓度提升至0.5 mg/mL，SOD活力无明显增强（P>0.05）。表2表明，0.25 mg/mL的维生素C浓度提升秀丽隐杆线虫SOD和CAT活力。

2.2 高氧环境中维生素C提升线虫存活率

在NGM平板中加入1‰过氧化氢（H2O2）后，形成高氧环境。与对照组0 mg/mL相比，高氧环境中线虫寿命缩短。此外，在高氧环境中，0.25 mg/mL维生素C饲养线虫寿命得到部分回复（图1），0.25 mg/mL的维生素C具有保护线虫应对高氧环境的作用。

2.3 维生素C对线虫抗氧化基因表达水平的影响

检测0 mg/mL（对照组）维生素C饲养线虫和0.25 mg/mL维生素C饲养线虫age-1、ctl-1、sir-2.1、daf-2、daf-16基因的mRNA水平。与对照组相比，0.25 mg/mL维生素C饲养线虫daf-16 mRNA水平增加（P<0.05），daf-2、age-1mRNA水平下降（P<0.05），ctl-1、sir-2.1 mRNA水平无明显变化（P>0.05）（表3）。

2.4 高氧环境中维生素C通过DAF-16胰岛素信号途提升線虫存活率

将0 mg/mL（对照组）线虫、0.25 mg/mL维生素C饲养线虫、0.25 mg/mL维生素C饲养age-1RNAi线虫和0.25 mg/mL维生素C饲养daf-16 RNAi线虫转移到含1‰ H2O2及对应浓度维生素C平板（加入产卵抑制剂FUDR）中，每组3板，每板30条线虫左右。每间隔2 d观察线虫存活情况，直至所有平板所有线虫死亡为止，实验重复3次。与0 mg/mL（对照组）相比，0.25 mg/mL维生素C饲养线虫寿命增加（P<0.05），0.25 mg/mL维生素C饲养daf-16 RNAi线虫寿命无明显变化（P>0.05），0.25 mg/mL维生素C饲养age-1RNAi线虫寿命增加（P<0.05）（图2）。age-1表达量降低增强daf-16的活性，从而增强线虫抗逆境的能力，而daf-16的活性降低线虫存活率无明显变化，表明age-1、daf-16信号通路在维生素C调控线虫抗氧化中的关键作用。

2.5 H2O2高氧应激情况下维生素C增加DAF-16入核

比较在H2O2高氧条件下，0 mg/mL（对照组）线虫、0.25 mg/mL维生素C饲养线虫DAF-16蛋白入核情况，0.25 mg/mL维生素C饲养线虫高于0 mg/mL（对照组）线虫（P<0.05）（图3）。H2O2高氧情况下，维生素C促使线虫DAF-16蛋白入核来增强线虫抵抗高氧环境。

3 讨论

线虫体内存在SOD、CAT分别负责清除线虫体内过量的超氧化物自由基和H2O2，抗氧化酶活力的升高标志着线虫抗氧化能力的增强。daf-16是FOXO（叉头转录因子）家族的同源物，受到age-1和daf-2活性的抑制，在线虫的寿命、免疫及应激等方面发挥正调控作用[11]，其中，daf-2是人胰岛素/胰岛素样生长因子受体家族的同族体[12]、age-1是哺乳动物磷脂酰激酶-3-羟基激酶的同族体[13]。研究表明，age-1基因突变后，个体表现出寿命延长的表型，同时在氧化应激条件下，daf-2突变体也表现出比野生型更强的抵抗能力[14]。线虫体内daf-2受体与胰岛素配体结合后可以引发激酶级联反应，磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶age-1[13]，而age-1又可通过AKT-1/AKT-2/SGK-1通路引起叉头转录因子daf-16磷酸化[14-15]。daf-16的活性大小调节该信号通路对机体寿命影响，因此daf-16被认为是机体寿命、热刺激以及抵抗氧化应激的重要监控器，可激活为靶基因如sod-3和ctl-1[16-19]等。研究发现，0.25 mg/mL维生素C饲养线虫后，SOD和CAT水平增加，体内的daf-2、age-1的表达量均下降，同时daf-16表达量上调并大量进入细胞核从而增强线虫抗逆境的能力，这说明维生素C可以通过参与daf-16胰岛素信号通路的调控来增强线虫的抗氧化能力。◇

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Vitamin C Enhances Antioxidant Activity Through Insulin Signaling Pathway in Caenorhabditis elegans

FU Wen，BAI Hua，WANG Yao，LI En-shuang，QIAN Yu-xia，YANG Jiao，ZOU Wei

（School of Public Health，Kunming Medical University，Kunming 650500，China）

Abstract：Objective To investigate the antioxidation effect and mechanism of vitamin C in model organism Caenorhabditis elegans.Method Caenorhabditis elegans was cultured in Nematode Growth Medium containing vitamin C of different mass concentrations（0.05，0.25，0.5 mg/mL）.The contents of superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）was detected，then the mRNA changes of age-1，daf-2，daf-16，sir-1，clt-1 genes was detected by qPCR.Meanwhile，we verified the survival rate after interference the daf-2 or daf-16 gene expression and observed the situation of DAF-16 enter the nucleus in the H2O2 oxidative stress environment treated by 0.25 mg/mL of vitamin C.Result The result showed that 0.25 mg/mL of vitamin C increased the activity of superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）.In the H2O2 oxidative stress environment，0.25 mg/mL of vitamin C up-regulated the expression level of daf-16 gene，down-regulated the expression level of age-1 and daf-2 gene，and increased DAF-16 entering the nucleus.Conclusion Vitamin C enhances the antioxidant activity through DAF-16 insulin signaling pathway in Caenorhabditis elegans.

Keywords：Caenorhabditis elegans;antioxidative effect;vitamin C;insulin signaling pathway

基金項目：云南省基础研究计划（昆医联合专项）（项目编号：2018FE001-309）;云南省教育厅科学研究基金（项目编号：2017ZDX159）。

作者简介：傅 雯（1998— ），女，学士，研究方向：生物分析与检测。

通信作者：邹 伟（1988— ），男，博士，讲师，研究方向：生物分析与检测。