乳清蛋白肽对衰老模型小鼠的抗氧化和学习记忆改善作用

于晓晨 李臻 刘欣然 胡佳妮 刘睿 珠娜 李勇

摘 要：目的：探讨乳清蛋白肽对衰老模型C57BL/6N小鼠的抗氧化和学习记忆改善作用。方法：采用SPF级雄性C57BL/6N小鼠72只，随机选取12只作为空白对照组，其余小鼠采用D-半乳糖100 mg/kg BW腹腔注射造模，连续造模6 w，期间空白对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水。6 w后内眦取血，测定血清MDA水平，并按MDA水平随机分为模型对照组、乳清蛋白组1.5 g/kg BW和3个乳清蛋白肽干预组（0.3、1.5、3.0 g/kg BW）。每日经口灌胃给予受试样品水溶液，干预周期为30 d，期间继续维持模型对照组、乳清蛋白组及乳清蛋白肽组D-半乳糖及空白对照组生理盐水腹腔注射造模。干预结束后，按开阔场实验、水迷宫实验、新物体识别实验顺序进行行为学实验。行为学实验结束后，对小鼠血清、肝脏及脑组织氧化应激相关指标进行检测。结果：与空白对照组相比，D-半乳糖衰老模型小鼠显示出了运动、探索及学习记忆能力障碍，模型组小鼠抗氧化酶水平低于空白组、脂质过氧化和羰基化蛋白水平高于空白组。与模型对照组相比，乳清蛋白肽可显著改善衰老小鼠空间探索、空间及非空间学习记忆能力，并提高血清及肝脏SOD、GSH-Px活力，改善血清及脑组织脂质过氧化物与羰基化蛋白累积水平。结论：乳清蛋白肽对衰老模型小鼠具有抗氧化和改善学习记忆作用。

关键词：乳清蛋白肽;衰老模型;抗氧化;学习记忆

“衰老”是随着年龄增加机体逐渐出现的退行性变化，表现为功能代谢水平的异常、外界环境适应能力的降低及抵御刺激损害能力的下降[1]。据世衛组织统计，60岁及以上人口的绝对数预计将从2015年的9亿人增长至2030年的14亿及2050年的21亿，并有望在2100年突破32亿[2]。老年人口占比数目正在不断增长，各种与衰老相关的问题需要引起世界各国的重视。目前各界对于衰老的机制尚存争议，20世纪50年代，Gerschaman提出了自由基理论[3]，该理论认为，自由基对细胞成分或细胞间组分造成的损害，是与机体衰老相关的生理生化功能受损的主要原因。正常情况下，机体组织细胞在代谢过程中发生氧化还原状态的可逆性改变并不断产生自由基，机体含有内源性抗氧化剂包括酶与非酶途径，主要的抗氧化酶有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等，其参与了正常状态下自由基的清除功能。当各种内源性和/或外源性来源的活性氧自由基产生过多造成累积，或机体的抗氧化清除能力下降时，内源性防御系统及自由基之间的平衡将会被打破，由此产生氧化应激，逐渐对细胞造成持续及累积的氧化损伤，这种损伤多表现在对生物大分子，如脂质、蛋白质及DNA的潜在危害中，在机体内表现为组织及器官中脂质过氧化物丙二醛（MDA）及羰基化蛋白（PC）的累积[4]。

伴随增龄正常老年人客观上存在脑老化，脑衰老会造成神经系统的退行性改变，严重时可引起轻度认知障碍、阿尔兹海默病等老年常见疾病，其表现为不同程度的学习记忆能力受损及认知障碍。学习记忆能力是指人和动物根据已经获得的经验改变自身行为活动以适应环境变化的过程，其功能的正常维持被认为与海马结构及大脑中神经元、突触间的相互作用与相互联系有关[5]。伴随衰老脑组织内需氧量不断提升，且对外界氧化应激敏感程度较高，使得脑组织内易发生过量的自由基堆积，无法有效地进行自我清除，进而导致神经干细胞及神经元损伤，致使正常神经功能严重破坏，最终导致学习记忆能力的下降[6]。因此探寻天然抗氧化剂，更安全有效地通过干预氧化应激损伤来延缓脑老化，并减缓衰老相关海马神经元损伤改善学习记忆障碍，对实现健康老龄化，并提升老年人生活福祉至关重要。

乳清是牛乳副产品奶酪及酪蛋白生产过程中主要的副产物，占乳总体积的85%～95%，约含有一半牛乳营养。据悉，每年乳清产量超过1.6亿t[7]，不当处理方式不但会引起污染问题也会造成资源的流失，因此合理处理回收利用乳清已成为研究热点。乳清中的蛋白质成分乳清蛋白属于优质蛋白，含有人类所需的8种必需氨基酸，受益于其各种有效组分，如β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白等，其已被应用于健身及医疗保健等多种行业当中[8]。

生物活性肽是由食品蛋白质经酶解产生的分子结构介于氨基酸及蛋白质之间的化合物，多数含有2～20个氨基酸，通常富含疏水性氨基酸。从食物蛋白质成分中提取的生物活性肽，通常对胃肠消化酶具有天然抗性[9]，经口服摄取的生物活性肽可以确保生物利用度，并使其有机会发挥生理效用，且具有高吸收、不易过敏、耗能低、无竞争抑制等特点[10]。乳清蛋白肽是乳清蛋白的酶解产物，作为食物提取的生物活性肽其在安全无副作用的前提下，具有多种生物活性，如降血糖[11]、改善血脂[12]、免疫调节[13]等。但目前关于乳清蛋白肽对衰老相关抗氧化及学习记忆改善作用研究的文献报道较少，故本实验使用D-半乳糖进行衰老模型造模，应用不同剂量的乳清蛋白肽对小鼠进行灌胃干预，通过行为学实验评价其对衰老个体的学习记忆改善的作用，同时对氧化应激相关指标进行检测，探讨乳清蛋白肽改善衰老相关氧化应激及学习记忆功能的可能机制，为乳清蛋白肽的功能开发利用提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳清蛋白肽（WHP），乳白色固体粉末，是通过特殊错流过滤工艺从乳清中提取蛋白浓缩物，后经生物酶解技术从乳清蛋白中分离得到的小分子生物活性肽类混合物。本研究使用Hilmar公司生产的WHP 8350。WHP 8350水解度为12.5%，蛋白质含量82%，分子量小于1 000 Da的低聚肽占40.5%，分子量小于5 000 Da的低聚肽占67.2%，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、赖氨酸含量较多。

健康SPF级C57BL/6N近交系小鼠，雄性，72只，6月龄，体重（40±10）g。由北京大学医学部实验动物中心提供。饲养于屏障级动物室，温度范围为（22±2）℃，相对湿度为 50%～60%，昼：夜明暗交替时间为 12 h：12 h。由北京大学医学部实验动物中心提供（实验动物许可证号：SYXK（京）2011-0039;实验动物生产许可证号：SCXK（京）2011-0012）。

紫外分光光度计，UV-2000（UNIC）;全自动生化仪，AU480贝克曼（美国）;总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（WST-1法）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测定试剂盒（比色法）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）、蛋白质羰基含量测定试剂盒（紫外比色法），南京建成生物科技。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 小鼠饲养在北京大学医学部实验动物科学部，实验期间自由饮食、饮水。动物适应性喂养1 w后，随机选取12只小鼠作为空白对照组。除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖100 mg/kg BW腹腔注射造模，注射量为0.1 mL/10 g，空白对照组用等量生理盐水腹腔注射，每日1次连续造模6 w。6 w后采用尾静脉取血，以3 000 r/10 min的转速分离血清，测定血清中MDA含量，并按MDA水平随机分组。分组后各模型组比较MDA水平均无显著性差异，但与空白对照组相比MDA均有显著性差异。

模型建立后基于各小鼠血清MDA水平，将其随机分为1个模型对照组，1个乳清蛋白组（1.5 g/kg BW）和3个乳清蛋白肽干预组（0.3、1.5、3.0 g/kg BW）。每日经口灌胃给予受试样品，空白对照组和模型对照组给予高压消毒蒸馏水，乳清蛋白组和乳清蛋白肽组给予相应浓度受试物，溶液均用蒸馏水配制。在给予受试样品的同时，模型对照组、乳清蛋白组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖腹腔注射，空白对照组给予生理盐水腹腔注射。动物每周称重两次，按体重调整受试样品剂量。受试样品给予时间30 d。实验过程中每周观察各组小鼠的一般情况，包括毛色、精神状态、摄食及日常活动情况等。30 d干预结束后，进行行为学实验及相关指标的测定。

1.2.2 行为学实验 连续干预30 d后，于第31天按照开阔场实验、Morris水迷宫实验、新物体识别实验的顺序依次开始行为学实验。为减小系统误差、保证实验前后观察的一致性，所有实验均由固定人员负责、实验全程减少人员走动、保持安静。每两个行为学实验之间至少间隔2 d，以消除干扰。

（1）开阔场实验：开阔场实验在长×宽×高为45 cm×45 cm×45 cm的木质箱内进行，内衬黑色垫纸，底部为白色，并画有5×5正方格。实验开始时将小鼠轻轻放入中央格中，记录5分钟内小鼠的跨格次数、站立次数、进入中央格的次数、中央格停留时间、外周格停留时间和粪粒个数。（2）Morris水迷宫实验：整个实验过程分為定位航行实验和空间探索实验两部分。①定位航行实验：用于评估小鼠在水迷宫中的学习和记忆能力。实验总用时为6 d，测试期间，将平台置于圆池内第一象限中央，固定于水下1～1.5 cm，水温保持在（21±1）℃，每天小鼠分别从东、西、南、北4个象限面向池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水到找到平台所需的时间记为逃避潜伏期，并同时记录游泳路程和游泳速度。每次测试间隔5 min，4次成绩的平均值作为当日最终成绩记录。如果动物在60 s内未找到平台，则将由实验者将其引导至平台并在平台上停留10 s，逃避潜伏期记为60 s。②空间探索实验：用于测量小鼠对平台空间位置学习的记忆保持能力。实验第7天，将平台从实验装置中移除，将小鼠从第三象限任一入水点置于水中。记录小鼠从入水到第一次到达平台所在位置的时间记为逃避潜伏期，并同时记录60 s内小鼠在目标象限（定位航行实验中平台所在象限）的停留时间、目标象限游泳路程及准确穿越平台所在位置的次数。（3）新物体识别实验：新物体识别实验在一个旷场实验装置（40 cm×40 cm×40 cm）中进行。实验中准备A、B、C 3个物体，其中A及B为相同物体，C与A、B形状及大小均不相同，所有物体保证重量足够以防止小鼠推动。实验分为适应、训练、检测三个步骤：①适应期：将小鼠置于旷场实验装置中央，并不放置任何物体，自行适应性活动5 min。②训练期：在适应期后1 d，旷场内放入A及B两个相同物体，分别与装置两侧壁间隔10 cm。将小鼠背对物体，从距物体等距离处放入，观察5 min，记录小鼠探索A及B物体的时间。③检测期：与适应期实验间隔5 h，用物体C替换物体B置于旷场内相同位置，同样将小鼠背对物体，从盒中距物体等距离处放入，观察5 min，记录小鼠探索A及C物体时间。以小鼠鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2 cm范围内探究的时间记为T，前爪触及物体、嗅、舔、咬等均记录为小鼠对物体的探索过程，爬上物体或攀越物体的时间不算在T内。使用文献中的公式计算新物体识别指数（NOI）：新物体识别指数=探索新物体的时间/（探索新物体时间+探索旧物体时间）×100%[14]。

1.3 氧化应激相关指标的测定

行为学实验结束后进行眼球采血，并使用颈椎脱臼法处死小鼠，分离肝脏及脑组织备用。血液于4 ℃冰箱放置3 h待凝固，2 000 r/min离心15 min，分离血清。采用试剂盒测定血清、肝脏及脑组织氧化应激相关指标（血清及肝脏SOD、GSH-Px、MDA及PC水平;脑组织MDA及PC水平）。

1.4 统计方法

正态及非正态分布的连续变量分别以平均数±标准差表示;分类变量以个数（百分数）表示。采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析，采用LSD法进行两组间比较;方差不齐时采用Tamhane和Dunnett法进行post-hoc分析。P<0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 乳清蛋白肽对衰老模型小鼠开阔场实验跨格次数及站立次数的影响

如表1所示，开阔场实验中，模型对照组小鼠跨格次数及站立次数与空白对照组比较显著减少（P<0.05）。乳清蛋白肽中、高剂量组小鼠跨格次数显著高于模型对照组（P<0.05）;与模型对照组相比，乳清蛋白组、乳清蛋白肽低、中、高剂量组小鼠的站立次数显著提高（P<0.05）;各组小鼠进入中央格次数、中央格停留时间及粪便个数无显著性差异。

2.2 乳清蛋白肽对衰老模型小鼠Morris水迷宫实验定位航行及空间探索的影响

如表2、图1所示，随着训练天数的增加，各组小鼠逃避潜伏期时长呈下降趋势，在第6天定位航行实验中，与第1天相比空白对照组、乳清蛋白组及乳清蛋白肽低、中、高剂量组小鼠逃避潜伏期显著缩短（P<0.05），而模型对照组小鼠第6天逃避潜伏期与第1天无显著性差异。与空白对照组相比，模型对照组小鼠游泳速度在第1、3、6天均显著减小（P<0.05）;各组游泳路程无显著性差异。如表3所示，在空间探索实验中，模型对照组小鼠逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留时间及目标象限路程均显著小于空白对照组（P<0.05）;乳清蛋白组目标象限路程显著大于模型对照组（P<0.05），乳清蛋白肽高剂量组逃避潜伏期、目标象限停留时间及目标象限路程均显著大于模型对照组（P<0.05）。如图2所示，空白对照组、乳清蛋白肽中、高剂量组小鼠在平台所在象限运动占比较高，停留时间较长，模型对照组小鼠运动较少时间围绕平台及经过平台所在象限。

2.3 乳清蛋白肽对衰老模型小鼠新物体探索时间识别指数的影响

如表4所示，各组训练期辨别指数NOI’均无显著性差异。模型对照组小鼠检测期辨别指数NOI显著低于空白对照组（P<0.05）;乳清蛋白肽中剂量组检测期辨别指数NOI显著高于模型对照组（P<0.05）。

2.4 乳清蛋白肽对小鼠抗氧化相关指标的影响

如表5、表6所示，与空白对照组相比，模型对照组血清及肝脏SOD、GSH-Px活力均显著下降（P<0.05）。与模型对照组相比，乳清蛋白组血清SOD活力显著升高（P<0.05），乳清蛋白肽中、高剂量组小鼠血清、肝脏SOD活力均明显升高（P<0.05）。与模型对照组相比，乳清蛋白组血清GSH-Px活力显著提高（P<0.05），乳清蛋白肽中、高剂量组小鼠血清、肝脏GSH-Px活力分别有显著提升（P<0.05）。

2.5 乳清蛋白肽对小鼠MDA及羰基化蛋白水平影响

如表7、表8所示，与空白对照组相比，模型对照组血清及脑组织内MDA含量均显著提升（P<0.05），模型对照组血清、肝脏及脑组织内羰基化蛋白PC含量也均显著高于空白对照组（P<0.05）。与模型对照组相比，乳清蛋白肽中、高剂量组小鼠血清、脑组织MDA含量分别有显著降低（P<0.05）。与模型对照组相比，乳清蛋白肽高剂量组小鼠血清及脑组织PC含量均显著减少（P<0.05）。

3 讨论

衰老伴随的生理生化功能衰退是每个个体不可避免的，增龄会导致大脑功能出现不同程度上的损伤，典型表现为学习及记忆功能的障碍。本研究采用了多种行为学实验方法针对乳清蛋白肽干预衰老模型小鼠的学习记忆功能進行评价，开阔场实验用于评价小鼠的自发空间探索能力，Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于脑空间学习记忆机制研究的一种实验手段，目前被广泛应用于衰老相关实验当中[15]，新物体识别实验是通过记录小鼠对物体的探索时间，检测小鼠非空间记忆能力的精密、敏感的行为学检测方法[16]。三种行为学结果表明，D-半乳糖衰老模型小鼠在开阔场实验、Morris水迷宫实验及新物体识别实验中，均体现了不同程度的运动、探索及学习记忆能力障碍。而研究显示，通过不同剂量的乳清蛋白肽对衰老模型小鼠进行干预，能够显著提高其开阔场实验中小鼠的跨格次数及站立次数，缩短定位航行试验中小鼠的逃避潜伏期，增加小鼠空间探索实验中目标象限停留时间及目标象限路程，并改善NOR实验中小鼠对新物体识别认知的非空间学习记忆能力，证实乳清蛋白肽具有改善衰老相关学习记忆障碍的作用。

自由基理论认为，与衰老相关的生化及生理衰退是由细胞代谢过程中活性氧自由基形成对细胞的氧化损伤积累引起的，伴随年龄增长细胞产生自由基及自身抗氧化防御/损伤修复机制出现不平衡，这种不平衡成为了衰老背后的驱动力[17]。这与本研究结果相符，D-半乳糖腹腔注射构造的衰老模型小鼠显示出了内源性抗氧化酶SOD及GSH-Px活力的下降，其血清、肝脏及脑组织中表现出了不同程度的脂质过氧化物丙二醛及蛋白质过氧化物羰基化蛋白水平的累积。超氧化物歧化酶SOD及谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px是机体抵御活性氧自由基损伤的内源性防御措施，SOD能够将O2转化为H2O2后在过氧化氢酶的作用下分解为水和氧，在组织羟基自由基的清除中起到重要作用。GSH-px可以通过将还原性谷胱甘肽氧化为谷胱甘肽二硫化物，再通过谷胱甘肽还原酶还原成为谷胱甘肽，从而将过氧化物及羟基自由基转化为无毒形式[4]。本研究结果显示，与模型对照组相比，乳清蛋白肽中剂量组小鼠血清SOD、肝脏SOD及血清GSH-Px活力升高，高剂量组小鼠肝脏SOD及GSH-Px活力显著提升，显示出了乳清蛋白肽具有提升衰老模型小鼠内源性抗氧化酶的作用。

国内外研究显示，氧化应激损伤与衰老相关学习记忆障碍密切相关。大脑是神经系统的最高中枢，相较于其他器官其自身遭受自由基损害的风险增加，更易受到活性氧自由基造成的损伤，原因在于：（1）大脑高能活动的正常维持需要大量的能量及氧气供应，消耗呼吸系统提供的约20%氧气，神经元作为大脑的基本功能单元，其代谢率高于其他细胞更容易受到氧化损伤。（2）与其他组织相比，脑组织抗氧化防御酶的含量相对较低。（3）脑组织内含有诸多有助于氧化还原循环的过渡金属。（4）大脑脂质中具有高含量的多不饱和脂肪酸，可与活性氧相互作用，导致脂质过氧化及破坏分子自传递级联反应，其氧化易产生具有神经毒性大过氧化产物如MDA等[18-19]。除了自由基对脂质大分子的损害外，氧化应激对老龄人学习记忆功能的损伤还表现在蛋白质的氧化上，研究显示，羰基化蛋白水平随年龄的增长而增加，是代表大脑衰老的重要标志，蛋白质的氧化修饰会削弱其功能，导致蛋白质稳态失衡，诱导蛋白质错误折叠、异常剪切的发生，进而表现为学习及记忆功能的障碍[20-21]。在本研究中，D-半乳糖衰老模型小鼠血清及脑组织显示出了较高的MDA累积水平，同时血清、肝脏及脑组织中羰基化蛋白水平也显著高于空白对照组，说明了模型组小鼠出现了脑老化相关的氧化应激损伤表现。然而，在乳清蛋白肽的干预下，与模型对照组相比，中剂量组小鼠显示出了较低的血清MDA水平，高剂量组小鼠则表现出了血清及脑组织MDA累积水平的降低，同时血清及脑组织PC水平均显著下降，说明了乳清蛋白肽具有改善衰老小鼠血清及脑组织氧化应激水平的作用，同时与行为学实验结果结合分析，提示乳清蛋白肽干预学习记忆障碍的作用可能与降低氧化应激损伤并改善机体抗氧化水平相关，其具体机制仍需根据进一步研究进行探讨。

4 结论

综上所述，乳清蛋白肽能够改善D-半乳糖模型小鼠在开阔场实验的空间探索能力、水迷宫实验及新物体识别实验的学习与记忆能力，具有显著的干预衰老相关学习记忆障碍效用，其作用机制可能与改善机体内源性抗氧化酶活性，降低脂质过氧化及蛋白质过氧化水平相关。本实验为乳清蛋白肽的开发利用提供科学依据。◇

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Effects of Whey Protein Peptide on Antioxidant and Learning and Memory Improvement in Aging Model Mice

YU Xiao-chen，LI Zhen，LIU Xin-ran，HU Jia-ni，LIU Rui，ZHU Na，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China）

Abstract：Objective To investigate the antioxidant and learning and memory improvement effects of whey protein peptide on aging model C57BL/6N mice.Method Using 72 SPF male C57BL/6N mice，among them，12 mice were randomly selected as the blank control group，and the remaining mice were modeled by intraperitoneal injection of D-galactose 100 mg/kg BW.The models were made for 6 weeks，during which the mice in the blank control group were injected with the same amount of normal saline.After 6 weeks，blood was taken from the inner canthus and the serum MDA level was measured.According to the MDA level，the 60 mice were randomly divided into a model control group，a whey protein group 1.5 g/kg BW and 3 whey protein peptide intervention groups（0.3，1.5，3.0 g/kg BW）.The test sample aqueous solution was given by oral gavage every day.The intervention period was 30 days.During this period，the model control group，whey protein group and whey protein peptide group were maintained as D-galactose and the blank control group were injected intraperitoneally with normal saline.After the intervention，conduct behavioral experiments in the order of open-field test，Morris Water Maze experiment，and Novel Object Recognition experiment.After the behavioral experiment is over，the oxidative stress related indicators of mouse serum，liver，and brain tissue are tested.Result Compared with the blank control group，D-galactose aging model mice showed obstacles in exercise，exploration，learning and memory.The level of antioxidant enzymes in the model group was lower than that of the blank group，and the levels of malondialdehyde and protein carbonyln were higher.Compared with the model control group，whey protein peptide can significantly improve the spatial exploration，spatial and non-spatial learning and memory abilities of aging mice，increase the activity of serum and liver SOD，GSH-Px，and improve the accumulation of malondialdehyde and carbonylated protein in serum and brain tissue.Conclusion Whey protein peptide has anti-oxidation and improved learning and memory in aging mice.

Keywords：whey protein peptide;aging model;antioxidant;learning and memory

作者簡介：于晓晨（1996— ），女，硕士研究生，研究方向：营养与疾病。

通信作者：李 勇（1958— ），男，教授，博士，研究方向：营养与疾病。