UPLC-MS/MS法同时测定毕氏海蓬子中13个功能成分

邵阳阳 赵善仓冯温泽 张梅 郑颜 董燕婕 范丽霞 王磊 李大鹏 冯立田

摘 要：利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法同时测定毕氏海蓬子（Salicornia bigelovii，SB）中没食子儿茶素、表没食子儿茶素、隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸、儿茶素、表儿茶素、异绿原酸-B、芦丁、异槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷13个功能成分的含量。样品利用甲醇提取，过0.22 μm滤膜后上机检测。采用C18 色谱柱 （100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）进行分离，以0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相，流速0.3 mL/min，柱温（35±5）℃，采用电喷雾离子源（ESI）、多反应监测（MRM）进行检测。结果表明：13个功能成分在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.99，该方法的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为1.0～20.0 μg/kg、2.0～50.0 μg/kg，平均加标回收率在89.10%～109.51%范围内。LC-MS/MS法測定毕氏海蓬子功能成分快速灵敏，准确可靠，可用于毕氏海蓬子中功能成分的检测。

关键词：毕氏海蓬子;液相色谱-串级质谱;多功能成分检测

毕氏海蓬子是一种耐盐性较强的盐生植物[1-3]，其口感脆嫩、形状似珊瑚、色泽如翡翠且具有丰富的黄酮、多酚等生物活性成分[4-10]，但对其成分的含量测定鲜见报道。本研究利用超高效液相色谱-串联质谱技术的快速、精准的特点[11-16]，建立同时测定毕氏海蓬子中没食子儿茶素、表没食子儿茶素、隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸、儿茶素、表儿茶素、异绿原酸-B、芦丁、异槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷13个成分含量的检测方法，为毕氏海蓬子的功能成分检测及盐生植物资源利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品

毕氏海蓬子，于2020年种植于爱姆海洋生物科技（烟台）有限公司烟台毕氏海蓬子繁育基地。供试材料为嫩苗期、开花期、成熟期植株的地上部分，采集时间分别为6月26日、8月28日、10月30日。采集嫩苗期、开花期、成熟期的毕氏海蓬子1 kg，分别冷冻干燥，粉碎后过20目筛，备用。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，美国Waters公司;AB5500三重四级杆串联质谱仪，美国AB SCIEX有限公司;高速离心机K15，扬州Sigma离心机有限公司;涡旋震荡仪IKA MS3，德国IKA工业设备公司;电子天平STP-FA2204，上海上平仪器有限公司;氮吹仪N-EVAP-112，美国Organomation公司;超声波清洗器KQ-800DE，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试剂

对照品没食子儿茶素（98%，970-74-1，上海源叶生物科技有限公司）、表没食子儿茶素（98%，970-74-1，上海源叶生物科技有限公司）、隐绿原酸（98%，905-99-7，上海源叶生物科技有限公司）、绿原酸（98%，327-97-9，上海源叶生物科技有限公司）、新绿原酸（98%，906-33-2，上海源叶生物科技有限公司）、儿茶素（98%，154-23-4，上海源叶生物科技有限公司）、表儿茶素（98%，490-46-0，上海源叶生物科技有限公司）、异绿原酸-B（98%，14534-61-3，上海源叶生物科技有限公司）、芦丁（98%，100080-201610，中国食品药品检定研究院）、异槲皮苷（98%，112007-201602，中国食品药品检定研究院）、褪黑素（98%，73-31-4，上海源叶生物科技有限公司）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（98%，111538-201606，中国食品药品检定研究院）、槲皮苷（98%，111538-201606，中国食品药品检定研究院）;甲醇、甲酸，均为色谱纯，购自Merck公司;水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

1.4 方法

1.4.1 标准溶液的配制 分别准确称取对照品没食子儿茶素、表没食子儿茶素、隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸、儿茶素、表儿茶素、异绿原酸-B、芦丁、异槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷10 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，制成浓度为1 mg/mL的单一对照品储备液。分别准确吸取10 μL上述标准品溶液，用甲醇定容至10 mL容量瓶，制成1 000 μg/L的混合对照品储备液，-20℃保存，备用。取上述的混合对照品储备液适量，加甲醇稀释成5、10、20、50、100、200、500 μg/L等7个浓度系列的混合标准工作溶液。

1.4.2 色谱条件 采用色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 column （100 mm×2.1 mm，1.7μm）（Waters，USA），流动相A为0.1%（v/v）的甲酸水，流动相B为甲醇。梯度洗脱条件见表1，进样量2 μL，柱温（35±5）℃，流速0.3 mL/min。

1.4.3 质谱条件 采用电喷雾电离，扫描方式为多反应离子监测，质谱数据采集及处理软件为MultiQuant 3.0.2工作站，具体参数：离子源喷雾电压：+4500 V/-4500V，气帘气：20.0 psi，雾化气：14 psi（表2）。

1.4.4 样品前处理 准确称取毕氏海蓬子粗粉（过2号筛）约2.5 g（精确到0.001 g）加入离心管，向离心管中加入10 mL甲醇，涡旋1 min，静置24 h后，超声1.5 h，于8 000 r/min离心10 min，取5 mL上清液，氮吹干后用2 mL的甲醇复溶，经0.22 μm的滤膜过滤后上机。

1.5 统计方法

采用Excel 2019进行数据录入编辑，以SPSS 25进行统计分析，组间比较采用单因素ANOVA方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 液相条件优化

选择0.1%甲酸-甲醇溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液、0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈溶液作为流动相，也对比了不同进样量（1、2、5 μL）和不同柱温[（25±5）℃、（35±5）℃、（45±5）℃]对 13种物质的标准品进行分析，最终选择峰形最好、保留时间最短的作为色谱条件。

2.2 质谱条件优化

试验过程中同时采用MRM和选择离子监测（SIM），结果发现，SIM条件下的各成分响应较低，尤其是低含量成分褪黑素和儿茶素类，无法实现定量分析，因此选择MRM扫描方式用于毕氏海蓬子中的13个成分。在MRM模式下，优化去簇电压、碰撞能量，选择响应最强的2个离子对分别作为定量离子对和定性离子对。

2.3 前处理条件优化

分别采用甲醇、50%甲醇水溶液、乙醇、70%乙醇水溶液进行提取，结果用甲醇提取时成分较多。在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h这5个时间段中，超声时间为1.5 h时提取成分较多。因此，选择甲醇作为提取溶剂、超声时间为1.5 h进行提取。

2.4 线性关系、检出限及定量下限

不同浓度系列的混合标准工作液溶液，按“1.4.2”“1.4.3”的设定方法进样。以各待测成分质量浓度（x）为横坐标、以各待测成分的峰面积（y）为纵坐标，得回归方程及相关系数，结果表明，13个成分在相应的范围内线性关系良好。配制混合标准工作液，稀释，分析检测，按信噪比S/N=3计算检出限，S/N=10计算定量限，结果见表3。

2.5 精密度

取混合对照品溶液，连续进样6次，测得没食子儿茶素、表没食子儿茶素、隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸、儿茶素、表儿茶素、异绿原酸-B、芦丁、异槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷峰面积的RSD分别为1.5%、2.5%、1.3%、1.8%、1.1%、2.1%、1.7%、1.4%、2.2%、1.6%、1.7%、1.3%、2.1%，結果表明，精密度良好。

2.6 重复性

按照“1.4.4”的方法制备同一批样品（SB-3）的供试品溶液，按照“1.4.2”、“1.4.3”的液质联用条件进行分析，结果表明，没食子儿茶素、表没食子儿茶素、隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸、儿茶素、表儿茶素、异绿原酸-B、芦丁、异槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷的平均含量分别为137.33、50.32、1 066.89、2 009.49、2 143.11、103.43、58.99、2 683.46、4 402.64、3 222.85、8.97、687.58、2 833.67 μg/kg，RSD分别为2.7%、3.5%、1.1%、1.9%、2.2%、3.4%、1.5%、2.6%、1.2%、1.7%、2.9%、1.9%、3.1%，结果表明，重复性良好。

2.7 稳定性

取“1.4.4” 中所应对的同一份供试品溶液，分别于0、8、24 h 进样检测，结果没食子儿茶素、表没食子儿茶素、隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸、儿茶素、表儿茶素、异绿原酸-B、芦丁、异槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷峰面积的RSD分别为2.3%、1.8%、2.7%、1.2%、1.8%、1.7%、1.1%、3.1%、2.6%、2.3%、1.4%、2.2%、1.3%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加标回收率

为了确定该方法的准确度，向样品中（SB-3，n=6）加入了不同浓度（50、100、200 μg/L）的制备的混合对照品储备液，进行了进样分析，结果见表4。

2.9 样品测定

取嫩苗期、开花期、成熟期（分别表示为SB-1，SB-2，SB-3）3批毕氏海蓬子，按“1.4.4” 的方法制备供试品溶液，进样检测，结果见表5。

3 结论

本试验建立了LC- MS/MS法同时测定毕氏海蓬子中没食子儿茶素、表没食子儿茶素、隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸、儿茶素、表儿茶素、异绿原酸-B、芦丁、异槲皮苷、褪黑素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷13个成分的含量，该方法前处理简单、精准、快速，为毕氏海蓬子的功能成分检测及盐生植物资源利用提供技术支撑。◇

参考文献

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Simultaneous Determination of 13 Functional Constituents in Salicornia bigelovii by UPLC-MS/MS

SHAO Yang-yang1，2，3， ZHAO Shan-cang2， FENG Wen-ze4，5， ZHANG Mei2，6， ZHENG Yan2，3， DONG Yan-jie2， FAN Li-xia2， WANG Lei2， Li Da-peng3， FENG Li-tian1

（1Jinan Winsir Biotechnology Co.，Ltd.，Jinan 250100，China;2Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Shandong Provincial Key Laboratory of Test Technology on Food Quality and Safety，Jinan 250100，China;3College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China;4 University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China;5Institute of Oceanology Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266071，China;6School of Agricultural Engineering and Food Science，Shandong University of Technology，Zibo 255000，China）

Abstract：The contents of 13 functional constituents such as gallocatechin，epigallocatechin，cryptochlorogenic acid，chlorogenic acid，neochlorogenic acid，catechin，epicatechin，isochlorogenic acid B，rutin，isoquercitrin，melatonin，kaempferol-3-O-rutinoside and quercitrin in Salicornia bigelovii were determined by UPLC-MS/MS.The samples were extracted with methanol，and then filtered through 0.2 μm membranes before using the UPLC-MS/MS system for determination.The separation was carried out on C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）with a mobile phase consisting of 0.1% formic acid-methanol at the flow rate of 0.3 mL/min.The column temperature was （35±5）℃.The salicornia bigeloviis were determined in the electrospray ionization mode and multiple reaction monitoring（MRM）mode.The results showed good linear relationships for all analytes in their respective ranges，with their correlation coefficients（R2）all above 0.99.The limits of detection（LOD）and the limits of quantifiction（LOQ）of the method were 1.0—20.0 μg/kg and 2.0—50.0 μg/kg，respectively.The recoveries of 13 functional constituents were in the range of 89.10%-109.51%.UPLC-MS/MS method is rapid，sensitive，accurate and reliable，so it can be applied to the determination of functional constituents in Salicornia bigelovii .

Keywords：Salicornia bigelovii;UPLC-MS/MS;multi-functional constituents detection

基金项目：山东省农业重大应用技术创新项目（项目编号：SD2019ZZ023）。

作者簡介：邵阳阳（1997— ），女，硕士研究生，研究方向：食品营养与人类健康。

通信作者：冯立田（1964— ），男，博士，研究方向：盐生植物资源的开发利用。