基于模拟胃肠道消化的云南民族乳制品蛋白肽研究

魏光强，施娅楠，万长江，黄艾祥,*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.大理农林职业技术学院工程学院，云南 大理 671003）

乳扇是云南大理、洱源地区白族人民食用的一种历史悠久、民族特色浓郁的传统乳制品，早在1563年明朝杨升庵所编著的《南诏野史》中就有记载，属酸凝拉伸型干酪，是将酸木瓜熬制的酸浆或经发酵后的酸乳清加热后，倒入牛奶使酪蛋白酸凝拉伸而成[1]，蛋白质量分数高达34%。乳饼是滇中彝族、路南撒尼族地区的一种传统山羊乳制品，距今已有600多年的历史，其营养丰富、风味独特，利用乳蛋白遇酸发生凝聚沉淀的原理制得，然后排乳清在模具里压制成型，属加热酸凝新鲜干酪[2-3]，蛋白质量分数为22%。奶渣是迪庆中甸地区藏族加工的一种传统乳制品，由羊奶或牛奶提取酥油后的奶水经微生物自然发酵剂发酵成熟后加工而成[4]。

现代营养学研究发现，人体摄入的蛋白质经消化道中的酶作用后大多以寡肽的形式被消化吸收，从而提供人体生长、发育所需的营养物质，而且机体对寡肽（二肽、三肽）的吸收代谢速度比对游离氨基酸快[5-6]。此外，寡肽具有多种生理功能，如抗高血压[7]、抗血栓[8]、免疫调节[9]、抑菌作用[10]等。体外消化模型是依据人体胃肠道消化液的主要成分及消化环境，在体外建立模拟消化体系，可用于食品生物利用度及营养价值等的评价。Basilicata等[11]对水牛奶的6 种乳制品（酸奶、冰淇淋和4 种奶酪产品）进行了模拟胃肠道消化肽谱鉴定，发现一些潜在的生物活性肽；Fontenele等[12]对巴西的Coalho奶酪进行模拟胃肠道消化研究，鉴定了116 种不同的消化肽，发现一些源于β-和αs1-酪蛋白的潜在生物活性肽；Liu Yufang等[13]监测了开菲尔羊乳在口腔，胃和小肠消化模型中肽谱的变化，通过数据库检索注释到16 种生物活性肽；Paolella等[14]对干腌巴马火腿模拟胃肠道消化后释放的肽进行了鉴定，鉴定出多达81 种源于肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的肽序列，分子质量主要在200～1 700 Da之间，一些已鉴定出具有潜在生物活性；Yu Yang等[15]对鹿茸蛋白进行模拟胃肠道消化肽谱鉴定和体外生物活性研究，从消化液中发现4 个被证明是DPP-IV（二肽基肽酶）和PEP（脯氨酰内切酶）的抑制肽，对降低血糖和改善记忆力有一定的作用。综上所述，蛋白在消化过程中能释放一些具有生物活性的多肽。

云南的传统民族乳制品乳扇、乳饼、奶渣属高蛋白乳制品，是生物活性肽的重要来源。目前对乳扇、乳饼、奶渣的模拟胃肠道消化肽谱和生物活性的研究鲜有报道。本实验以云南的民族乳制品乳扇、乳饼、奶渣为研究对象，基于体外消化模型、液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）和氨基酸分析研究3 种民族乳制品模拟胃肠道消化肽谱及游离氨基酸含量，并借助蛋白肽数据库分析潜在的生物活性。以期为乳扇、乳饼、奶渣胃肠道蛋白水解物中蛋白活性肽的研究提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳扇购自云南省大理州；乳饼购自云南省石林县；奶渣购自云南省迪庆州。

胃蛋白酶（695 U/mg）、胰蛋白酶（8×USP）、胰凝乳蛋白酶（1 500 U/mg）、胆汁盐 美国Sigma公司；甲酸、乙腈（均为色谱纯） 德国默克公司；三氯乙酸（分析纯） 天津市凤船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TGL20M高速冷冻离心机 湖南湘立科学仪器有限公司；匀浆机 德国IKA公司；ZQLY-180S振荡培养箱上海知楚仪器有限公司；FD-1A-50 冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；30氨基酸自动分析仪 英国Biochrom公司；Q Exactive四极杆质谱仪、Easy-nLC 1000液相色谱仪 美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 云南民族乳制品加工工艺流程

乳扇：酸乳清（pH 2.9～3.2）→加热（65～70 ℃）→添加牛奶（调整pH值至4.8）→凝乳→热烫拉伸成型→晾晒→成品。

乳饼：羊奶→加热杀菌（85～90 ℃）→添加酸乳清（酸乳清pH 2.9～3.2，调整pH值至4.8）→搅拌→凝块→过滤→压制成型→成品。

奶渣：牦牛奶→提取酥油→脱脂乳→加热杀菌→加酸乳清自然发酵→排乳清→堆码成型→奶渣。

1.3.2 样品前处理

样品脱脂：将样品切割为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，然后与蒸馏水按质量比1∶15进行混合，匀浆（10 000 r/min，20 min），匀浆液经离心（9 000×g，20 min），除去上浮脂肪，取上清液和底部酪蛋白，冷冻干燥（5～10 MPa、－50 ℃）得到冻干粉，－20 ℃保存，备用。

1.3.3 乳扇、乳饼、奶渣模拟胃肠道消化

参照Carriotti[16]和Monsoor[17]等的方法略作修改。模拟胃消化：准确称取1 g乳扇、乳饼、奶渣冻干粉溶解于20 mL去离子水中，并用0.5 mol/L HCl溶液调节pH值至2，然后加入胃蛋白酶（酶与蛋白质量比为1∶100），在37 ℃条件下振荡消化2 h，消化结束后通过在95 ℃下加热溶液15 min进行灭酶处理。模拟胰消化：将灭酶后的胃消化物用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5，然后加入胰酶，胰凝乳蛋白酶和胆汁盐，在37 ℃条件下振荡消化2 h，然后在沸水中加热15 min终止反应。最后将混合物于4 ℃、4 000×g离心10 min，取出上清液，用10 kDa的滤膜超滤，冷冻干燥（5～10 MPa、－50 ℃）得到冻干粉，－20 ℃保存，备用。

1.3.4 乳扇、乳饼、奶渣游离氨基酸含量测定

参照张微等[18]的方法，分别准确称取各样品（冻干粉）0.04 g，置于10 mL试管中，加1 mL水使溶解，并分别加入质量分数10%三氯乙酸溶液5 mL，于漩涡混合仪上混合5 min，静置10 min后4 000×g离心40 min，将上清液全部转入蒸发皿中，80 ℃水浴蒸干。用衍生缓冲液多次洗涤蒸发皿，将洗涤液转入25 mL容量瓶中，并用衍生缓冲液稀释至刻度，混匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，用氨基酸分析仪测定样品游离氨基酸组成。

1.3.5 LC-MS/MS鉴定乳扇、乳饼、奶渣蛋白肽

将要分析的冻干样品溶于体积分数0.1%甲酸溶液中，－20 ℃保存待用。色谱分析条件：A液为0.1%甲酸的水溶液，B液为含0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈体积分数为84%）。色谱柱以95%的A液平衡后，样品由自动进样器上样至Trap柱。0.5 H梯度。质谱分析条件：毛细管温度为200 ℃，电喷雾电压为1.8 kV，归一化碰撞能量为35.0%，一级扫描范围400～4 000 Da。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20 个碎片图谱（MS2scan）。质谱测试原始文件用Mascot 2.2软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。

1.3.6 乳扇、乳饼、奶渣蛋白肽数据库检索

Xcalibur采集的*.RAW文件用Proteome Discoverer Daemon（v1.4）转换成*.MGF格式，之后用Mascot 2.2软件在牛（bovine）、羊（capra）蛋白数据库中进行检索。数据库检索参数如下：不设置酶切、最大漏切数和固定修饰，可变修饰设置为甲硫氨酸的氧化（+15.994 9 D）。母离子的质量容忍偏差为20×10－6，碎片离子为0.1 Da。导出肽段时设置Score≥20，P＜0.01，显著性差异，同时控制假阳性率（false discovery rate，FDR）＜1%。通过数据库BIOPEP（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）和EROP-Moscow（http∶//erop.inbi.ras.ru/）检索，评估3 种传统乳制品消化产物中蛋白肽的潜在生物活性。

1.4 数据统计分析

采用Origin Pro 2018软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 乳扇、乳饼、奶渣的消化产物蛋白肽

2.1.1 基于LC-MS/MS的消化产物肽谱

乳扇、乳饼、奶渣按照1.3.3节处理后进行LC-MS/MS分析，基峰色谱图分别如图1A、B、C所示。3 种乳制品的基峰谱图存在一定的差异，乳扇的绝大多数高丰度的峰出现在16～24 min；乳饼峰出现在18～28 min；而奶渣峰出现在16～28 min。

2.1.2 3 种民族乳制品消化肽分子质量分布

乳扇、乳饼和奶渣的消化产物经LC-MS/MS进行肽段序列解析，之后进行蛋白肽数据库检索，分别得到221、225 条和220 条蛋白肽，图2呈现了3 种乳制品消化产物中蛋白肽分子质量分布情况。3 种乳制品消化肽分子质量在500～3 500 Da之间，由于LC-MS/MS对肽的检测范围为质荷比400～4 000 Da，对于太大、太小或信号强度太低的肽段均检测不到。乳扇中分子质量在750～1 000 Da之间的蛋白肽占比最多，占所有多肽的36.2%，其次为500～750 Da的蛋白肽，占31.7%；而乳饼和奶渣中分子质量在500～750 Da之间的蛋白肽占比最多，分别占30.7%和35.0%，其次为500～750 Da的蛋白肽，分别占25.85%和33.0%。分子质量分布能够体现蛋白水解、肽键断裂的程度，分子质量与消化产物的生物活性及消化吸收生物可利用度密切相关，3 种乳制品消化肽主要在500～1 000 Da之间，主要为小分子多肽，易于被胃肠道吸收。

2.1.3 3 种民族制品中源于酪蛋白和β-乳球蛋的消化肽

乳扇、乳饼和奶渣消化肽中源于酪蛋白和β-乳球蛋的肽段如表1所示。3 种乳制品消化肽中分别有58、52 条和43 条源于酪蛋白和β-乳球蛋。乳扇消化肽中源于β-酪蛋白的有18 条、αs1-酪蛋白16 条、αs2-酪蛋白11 条和β-乳球蛋白7 条；乳饼消化肽中源于β-酪蛋白的有20 条、αs1-酪蛋白7 条、αs2-酪蛋白11 条和β-乳球蛋白10 条；而奶渣消化肽中源于β-酪蛋白的有19 条、αs1-酪蛋白8 条、αs2-酪蛋白7 条、β-乳球蛋白6 条。3 种乳制品消化肽中来自于β-和α-酪蛋白的较多，原因是酪蛋白中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白含量较高，其灵活又开放的结构导致它们很容易被酶解，此外胃蛋白酶和胰蛋白酶更倾向于酶解β-酪蛋白，特别是在具有208 ～209和209～210片段残基的C末端部分以及具有残基A的N末端部分特别容易被消化酶酶解，αs1-酪蛋白在包含残基A1～R2的区域内的N末端部分特别是39～40和40～41片段易被降解。在本次研究中源于κ-酪蛋白的蛋白肽在3 种乳制品含量较低，分别从乳扇、乳饼和奶渣的消化产物中鉴定到6、4 条和3 条源于κ-酪蛋白的蛋白肽，推断是因为乳扇、乳饼、奶渣成熟期短，κ-酪蛋白降解较少，此外和κ-酪蛋白对胃肠道消化酶的抵抗作用相关。乳饼和奶渣消化肽中源于αs1-酪蛋白的蛋白肽比乳扇中的少，推断是差异物种之间的酪蛋白结构稳定性不同或是不同的加工工艺所造成的。

2.2 乳扇、乳饼、奶渣蛋白肽的潜在生物活性

乳源蛋白在胃肠道消化中释放产生的活性肽具有良好的吸收效果[19]，不仅能作为氨基酸的供体，而且也能作为生理调节剂发挥作用。本研究将乳扇、乳饼、奶渣消化肽中源于酪蛋白和β-乳球蛋的58、52 条和43 条通过数据库检索，探索潜在的生物活性肽，结果如表2所示。通过数据库检索注释到乳扇潜在的血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽5 条、免疫调节肽4 条、抗氧化肽3 条、抗血栓肽2 条以及抗菌肽1 条。其中源于αs1-酪蛋白f（001-024）的RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF[12]经牛凝乳酶催化23～24片段肽键的水解释放，并在伯南布哥州的传统Coalho奶酪中发现，具有抗菌活性。源于αs1-酪蛋白f（001～036）的FVAPFPEVFGK由杨铭等[20]先后用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解酪蛋后分离得到，为ACE抑制肽；源于β-酪蛋白130～140片段和κ-酪蛋白106～116片段的LHLPLPL[21]和MAIPPKK[22]从发酵乳和GMP的胰蛋白酶水解物的胃肠道消化液中被鉴定，具有舒张动脉的抗高血压作用；源于β-酪蛋白98～105片段的VKEAMAPK[23]在干酪中被鉴定，为ACE抑制肽。源于αs1-酪蛋白80～90片段、αs2-酪蛋白150～188片段和β-酪蛋白170～176片段的KEDVPSER[24]、KTKLTEEEKNRL[25]和VLPVPQK[26]从干酪、GMP的胰蛋白酶水解物和水牛奶酪蛋白中鉴定出，均具有抗氧化活性。源于β-乳球蛋白70～77片段和αs2-酪蛋白174～181片段的KYPVEPF[27]和FALPQYLK[28]已从乳清奶酪和酪蛋白的胰酶水解物中被鉴定出，具有抗血栓活性。源于β-酪蛋白192～209片段的LYQEPVLGPVRGPFPI、LYQEPVLGPVRGPFPIIV、YQEPVLGPVRGPFPI和QEPVLGPVRGPFPIIV[29]均具有免疫调节活性，主要由大量的肽酶，例如凝乳酶、组织蛋白酶和来自乳酸菌的能够水解192～193片段肽键的酶酶解产生，因此该肽在不同的奶酪品种中被广泛发现[30]。乳扇中鉴定到较多的生物活性肽，经人体食用后能提供免疫调节、舒张血管、降低血压等功效。

数据库检索注释到乳饼、奶渣中潜在抗氧化肽2 条，和乳扇中的潜在抗氧化肽一致，为源于αs1-酪蛋白f（080～102）的KEDVPSER[24]和β-酪蛋白170～176片段的VLPVPQK[26]。此外，奶渣中还检索注释到免疫调节肽2 条和抗血栓肽1 条，源于β-酪蛋白192～209片段的LYQEPVLGPVRGPFPI和LYQEPVLGPVRGPFPIIV[29]具有免疫调节活性；源于κ-酪蛋白106～112片段具有潜在的抗血栓活性，能够抑制ADP处理血小板的聚集和纤维蛋白原与ADP处理血小板的结合的MAIPPKK[22]。数据库检索到乳饼和奶渣中的潜在生物活性肽较少，原因是数据库中的大多数生物活性肽都来自于牛乳蛋白，来自于羊乳蛋白的活性多肽较少，从而导致羊乳蛋白肽的很多活性肽都无法得到注释。此外，牛和羊的蛋白质存在差异，从而导致羊和牛蛋白质之间缺乏匹配。

表1 乳扇、乳饼、奶渣消化产物蛋白肽氨基酸序列及分子质量Table 1 Amino acid sequences and molecular masses of peptides from dairy fan, milk pastry and milk residue after simulated gastrointestinal digestion

肽组学分析显示，酪蛋白中αs1-酪蛋白的1～36片段；β-酪蛋白的94～106、130～175和193～209片段以及κ-酪蛋白106～112片段的几个区域对胃肠道消化特别敏感，β-酪蛋白因其结构松散而更容易被消化酶酶解。3 种传统乳制品消化肽中潜在的免疫调节肽和ACE抑制肽较多，对调节人体免疫和调整人体血压方面具有一定的功效，夏镇波[31]采用胃蛋白酶、胰蛋白酶分别水解酪蛋白，均可获得ACE抑制肽，李素萍[32]研究表明乳源酪蛋白经过胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解后可以生成免疫调节肽，与本研究结果一致。本研究未能检索到3 种传统乳制品中潜在的酪蛋白磷酸肽、阿片肽等生物活性多肽，但随着科学技术发展，尤其是分子生物学技术成熟和应用的深入，传统乳制品中越来越多的生物活性肽将被发现。

表2 乳扇、乳饼、奶渣中的潜在生物活性肽Table 2 Potential biological activities of peptides from three ethnic dairy products

2.3 乳扇、乳饼、奶渣消化产物的游离氨基酸含量

氨基酸作为人体营养所需蛋白质的基本构成物质，也是食物经消化后被摄入的主要成分，因此氨基酸均衡对机体健康起到至关重要的作用。由表3可知，乳扇、乳饼、奶渣经模拟胃肠消化产物冻干粉中游离氨基酸丰富，除色氨酸外的其他所有氨基酸都被检测到，3 种乳制品中乳饼消化产物的游离氨基酸含量最高为10.7 g/100 g，其次是乳扇（9.45 g/100 g）、奶渣（9.0 g/100 g）。乳扇消化产物中中性、碱性氨基酸和酸性氨基酸含量分别为5.664、4.767 g/100 g和0.275 g/100 g，乳饼消化产物中中性、碱性氨基酸和酸性氨基酸含量分别为5.084、4.053 g/100 g和0.31 g/100 g，奶渣消化产物中中性、碱性氨基酸和酸性氨基酸含量分别为4.937、3.793 g/100 g和0.271 g/100 g。3 种乳制品消化产物中中性氨基酸含量最高，其次依次是碱性氨基酸和酸性氨基酸。说明3 种乳制品经人体消化后的游离氨基酸丰富，利于人体的吸收，能提供丰富的营养价值。

表3 乳扇、乳饼、奶渣消化产物的游离氨基酸含量Table 3 Free amino acid contents of dairy fan, milk pastry and milk residue after simulated gastrointestinal digestion

3 结 论

乳扇、乳饼和奶渣经模拟消化后分别鉴定到221、225 条和220 条蛋白肽，主要源于β-和α-酪蛋白。乳扇肽分子质量集中在500～750 Da，乳饼肽和奶渣肽分子质量集中在750～1 000 Da。蛋白肽数据库分析发现乳扇中潜在的功能活性肽较丰富，包括ACE抑制肽、免疫调节肽、抗氧化肽、抗血栓以及抗菌肽。乳饼肽中检索到的潜在生物活性肽较少，包括抗氧化肽2 条，原因可能是数据库中的大多数生物活性肽与牛乳相对应，对于羊乳产品中的多肽较少，很多肽段无法注释到活性。奶渣潜在的功能活性肽为免疫调节肽、抗氧化肽和抗血栓肽。乳扇、乳饼和奶渣经模拟消化液消化后的游离氨基酸含量分别为9.45、10.7 g/100 g和9 g/100 g，营养价值丰富。本研究可为云南民族特色乳制品进一步开发提供参考依据。