血清抗百日咳毒素中和抗体检测方法的建立及应用

张雨笑 ，谌志筠 ，孙琳 ，2，何秋水 ，3

1.首都医科大学基础医学院病原生物学系，北京100069；2.首都医科大学附属北京儿童医院呼吸疾病研究室，北京100045；3.芬兰图尔库大学医学微生物和免疫学系，图尔库20520

百日咳杆菌（Bordetella pertussis）系鲍特氏菌属成员，其感染所致的百日咳是婴幼儿多见的急性呼吸道传染病。自20 世纪50 年代许多国家开始大规模接种疫苗以来，百日咳的发病率和死亡率显著降低。WHO 于2008 年在全球范围内报告约1 600 万病例，95%的病例发生在发展中国家，其中195 000 例儿童死亡，可见百日咳是重要的全球公共卫生问题之一［1］。

尽管疫苗覆盖率较高，近年来我国和许多其他国家均出现百日咳发病率上升的情况，在个别地区甚至有不同程度的暴发流行［2-6］。本课题组前期血清流行病学调查表明，2016 年北京市20 ～39 岁育龄人群中百日咳发病率为4%，而抗体未检出率高达57.4%，表明育龄人群易感染百日咳杆菌［3］。家庭成员是婴幼儿患百日咳的最主要传染源［7-8］，育龄期人群百日咳发病率的升高，增加了婴幼儿患病的风险。

百日咳杆菌可产生多种毒力因子，其中百日咳毒素（pertussis toxin，PT）是其特异毒力因子，是无细胞百日咳（acellular pertussis vaccine，APV）主要抗原成分之一，感染和接种疫苗后可产生针对PT 的特异性抗体。因此，ELISA 法检测抗PT 特异性IgG 抗体（PT-IgG）可用于诊断百日咳杆菌的感染，也可评估感染或疫苗接种后的免疫持久性。由于PT 具有毒性，用于APV 生产时必须经化学物质进行脱毒处理。研究表明，甲醛脱毒的PT 不能被具有保护功能的单抗隆抗体1B7 和11E6 识别并结合，表明甲醛脱毒可使PT 重要的抗原表位丢失［9］。与自然感染比较，疫苗接种后产生抗PT 特异性抗体的中和能力会降低，因此，只检测PT-IgG 抗体浓度并不能完全说明抗体的功能。本研究利用PT 可使CHO 细胞簇集的特性建立抗PT 中和抗体的检测方法，并应用于检测健康成人血清中抗PT 中和抗体的含量。

1 材料与方法

1.1 细胞 CHO 细胞购自北京协和细胞资源中心。

1.2 PT 及血清 未脱毒的PT 纯化蛋白（105.5 μg／mL）由葛兰素史克公司惠赠；血清来源于在北京市朝阳区疾病预防控制中心体检的20 ～39 岁健康人群，从598 份经血清流行病学检测的血清样本中随机选取 109 份［3］。

1.3 主要试剂及仪器 PT-IgG 抗体ELISA 检测试剂盒购自德国维润赛润公司；DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）、0.05% EDTA-胰酶和 96 孔板均购自美国Corning 公司。

1.4 PT 最适终浓度的确定 将浓度为105.5 μg／mL的未脱毒PT 蛋白用含10% FBS 的DMEM 培养基进行10 倍系列稀释至105.5 ng ／ mL，再将其进行倍比稀释至0.1 ng ／ mL。将不同浓度未脱毒PT 蛋白（0.1 ～ 105.5 ng ／ mL）加入至 96 孔板中，每个浓度各设 8 个复孔，100 μL ／孔；加入浓度为 105个 ／mL的 CHO 细胞悬浮液，100 μL ／孔，并设细胞对照，于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中孵育24 h，置倒置显微镜下观察细胞簇集现象。结果以1 个视野下全部细胞出现簇集为阳性，定义为1 个致细胞病变单位（CPU），相反则为阴性。为可检测到低效价的中和抗体，PT 的最适终浓度规定为 4 CPU［10］。

1.5 方法的建立 将25 μL 待检血清加入至96 孔板第1 列，用含10% FBS 和1%青霉素-链霉素的DMEM 培养基进行倍比稀释（1 ∶4 ～ 1 ∶4 096），50 μL ／孔，每份血清设 2 个复孔；每孔加入 50 μL 浓度为最适终浓度的未脱毒PT 蛋白，37 ℃，5% CO2细胞培养箱中和 3 h；加入 105个 ／ mL 的CHO 细胞悬液，100 μL ／ 孔，继续培养 24 h，观察结果，并设细胞对照、PT 对照及血清对照。血清的中和抗体效价为不引起细胞簇集现象的最高稀释倍数［10］。每次试验使用同一份标准血清进行质量控制。

1.6 方法的重复性验证 随机选取8 份血清样品（编号分别为 10、52、93、622、629、672、962、978），每份样品用建立的方法重复检测4 次，计算变异系数（CV）。

1.7 方法的应用 采用PT-IgG 抗体ELISA 试剂盒及本实验建立的方法分别检测109 份血清样品的PT-IgG 抗体水平及PT 中和抗体水平，并分析两者的分布情况及相关性。

1.8 统计学分析 应用SPSS 24 统计学软件进行统计分析，血清PT-IgG 抗体浓度与中和抗体效价间的比较采用皮尔森相关系数法，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PT 的最适终浓度 PT 浓度为 0.21 ng ／ mL时，96 孔板中细胞全部产生簇集，此时PT 浓度记为1 个CPU，见图1。因此，确定PT 中和试验中，当每孔液体量为200 μL 时，PT 的最适终浓度为0.84 ng ／ mL。

图1 显微镜下观察CHO 细胞的簇集情况（× 100）Fig.1 Cluster of CHO cells under microscope（× 100）

2.2 方法的重复性 8 份血清重复4 次检测中和抗体含量结果CV 为0.00% ～12.28%，见表1。表明该方法重复性良好。

表1 重复性验证结果Tab.1 Verification for reproducibility

2.3 方法的应用

2.3.1 PT 中和抗体及PT-IgG 抗体的分布 109 份血清样品中，20 份血清样品的中和抗体效价为128 ～ 256，44 份为 32 ～ 64，25 份为 8 ～ 16，20 份 ＜ 8。中和抗体效价分布范围是 ＜4 ～256，中位数为32，几何平均效价（GMT）为 27.12（95% CI：20.78 ～35.39）。109 份血清样品中，PT-IgG 抗体的浓度 ≥100 IU ／ mL 的有 3 份，表示 1 年内感染过百日咳杆菌；40 ～ 100 IU ／ mL 的有 20 份，表示 2 ～ 3 年内感染过百日咳杆菌；＜ 40 IU ／mL 的有 86 份，表示 2 ～3 年内未感染过百日咳杆菌。PT-IgG 抗体分布范围为 0.03 ～ 184.80 IU ／mL，中位数为 21.17 IU ／mL，GMT为 13.33 IU ／mL（95%CI：9.95 ～ 17.87 IU ／mL）。

2.3.2 PT 中和抗体效价与IgG 抗体浓度的相关性109 份血清样品的PT-IgG 抗体浓度与中和抗体效价间呈明显相关性（r = 0.77，P ＜0.01）。但存在两者不一致的现象，23 份PT-IgG 抗体浓度 ≥ 4 0 IU ／ mL 的血清中，有2 份样品的中和抗体效价仅为32，6 份中和抗体效价为256，表明有2 例曾患过百日咳的体检人员血清样品抗体中和PT 毒性的能力有限。109 份血清样本的中和抗体效价为64 的31 份血清样品中，PT-IgG 抗体浓度范围为 10.8 ～ 77.8 IU ／ mL，见图 2。表明即使抗体浓度低，但其中和PT 毒性的能力较高。

图 2 20 ～39 岁健康人群血清中PT-IgG 抗体浓度与中和抗体效价的相关性Fig.2 Relationship between PT-IgG concentration and neutralizing antibody titer in sera of healthy individuals at ages of 20 ～39 years

3 讨 论

PT 是百日咳杆菌产生的特异毒力因子，尚未发现与其他病原微生物存在交叉反应。PT 为最复杂的可溶性细菌蛋白之一，具有典型的A-B 型结构（AB5），A 原体由具有酶活性的S1 亚基组成，其催化三聚体G 蛋白的α 亚基的ADP-核糖基化，从而干扰靶细胞的代谢功能。B 寡聚体由 1S2：1S3：2S4：1S5组成，负责与靶细胞受体的结合，并通过受体介导的内吞作用和逆向运输进行胞内运输［11-13］。HEWLETT等［14］使用 CHO 细胞检测 PT 毒性，观察到 PT 的毒性可使细胞变为圆形并形成簇，这种形态的改变是由于PT 催化了细胞底物的ADP-核糖基化［15］。目前，CHO 细胞簇集实验多用来检测无细胞百日咳疫苗中脱毒PT 的残余毒性［16-18］。人血清中特异性的PT 抗体可中和PT 的ADP-核糖基转移酶活性，进而抑制其引起的CHO 细胞簇集现象。本研究通过CHO 细胞簇集实验获得PT 最佳终浓度为 0.84 ng ／ mL，建立了PT 中和试验用于检测血清PT 中和抗体含量。重复性验证CV 为0.00% ～12.28%，表明建立的方法重复性良好。

血清中和抗体检测结果显示，育龄人群中PTIgG 抗体浓度与中和抗体效价之间呈明显相关性。但人群中存在PT-IgG 抗体浓度高，中和抗体效价低的现象，如23 份在2 ～3 年内感染过百日咳（PTIgG ≥ 40 IU ／ mL）的血清，其中和抗体效价的范围为32 ～256，最高的中和抗体效价为最低的8 倍。同时也存在中和抗体效价高，但PT-IgG 抗体浓度低的现象，如中和抗体效价为64 时，PT-IgG 抗体浓度范围为10.8 ～ 77.8 IU ／ mL，最高浓度为最低的 7.2 倍，表明PT-IgG 抗体的浓度并不能完全反映抗体的功能。目前常通过检测疫苗接种后抗体水平来评价疫苗效果，而无细胞疫苗生产过程中的化学脱毒会使PT 重要的抗原表位丢失，因此评价百日咳疫苗的效果尤其是无细胞疫苗的效果需同时检测抗体的水平和功能。

ELISA 法具有操作快捷的特点，广泛应用于百日咳的流行病学监测及评估机体接种疫苗或感染百日咳杆菌后的免疫反应［19］。本研究建立的CHO细胞簇集试验虽耗时较长，但重复性较好，可用于检测血清百日咳抗体的功能，进而更有效评估百白破组分疫苗的临床免疫效果，并评价疫苗效力与中和抗体水平的相关性。本实验采用的是未脱毒PT 蛋白，今后在该方法的应用中，需要考虑使用PT 国家参考品进行进一步验证。