甲型肝炎灭活疫苗（MRC-5 细胞）中乙二胺四乙酸二钠残留量HPLC 检测方法的建立及验证

樊雪，王一平，李璇，修雪亮，廖辉，周荔葆

辽宁成大生物股份有限公司研发部，辽宁沈阳110179

甲型肝炎（hepatitis A，HA）灭活疫苗（MRC-5 细胞）系将甲型肝炎病毒接种至人二倍体细胞中，经培养、收获、病毒纯化及灭活后，加入铝佐剂制成，用于预防甲型肝炎［1］。在HA 灭活疫苗生产工艺中，需加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）对细胞进行消化，后续工艺中可能有部分残留。EDTA-2Na 易与钙螯合，长期大剂量服用或静脉输注速度过快可引起低钙血症。研究表明，肾损伤、结核病及心脏功能损伤患者应慎用［2］。EDTA-2Na 与 FeCl3在酸性条件下发生络合反应，生成具有紫外吸收的稳定的络合物，因此可采用HPLC 法进行测定。目前，国内外HPLC 法检测EDTA-2Na 残留量主要应用于化学药品和食品领域［3-6］，疫苗中EDTA-2Na 残留量检测的参考文献较少。

本文建立了检测HA 灭活疫苗（MRC-5 细胞）中EDTA-2Na 残留量的HPLC 法，并对方法进行验证。

1 材料与方法

1.1 供试品及对照品 3 批HA 灭活疫苗原液供试品（批号：HAV20170202-原、HAV20170301-原及HAV20170302-原）由辽宁成大生物股份有限公司生产；EDTA-2Na 对照品（批号：K1424041）购自美国阿拉丁公司。

1.2 主要试剂及仪器 乙腈（批号：137696）及磷酸（批号：158625）购自美国Fisher 公司；磷酸二氢铵（批号：C10079253）购自上海 Macklin 公司；40%四丁基氢氧化铵（批号：A1703020）购自美国阿拉丁公司；FeCl3（批号：STBG6072）购自美国Sigma 公司；LC-2010A 型高效液相色谱仪购自日本SHIMADZU 公司；C18 色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）分别购自美国Thermo 公司和Waters 公司；所有试剂均为色谱纯。

1.3 色谱条件及优化 采用反相色谱柱。流动相为水相-有机相，水相为四丁基氢氧化铵的磷酸盐溶液（离子对试剂）［7-8］，用磷酸调 pH，经 0.22 μm 滤膜过滤，超声，有机相为乙腈；流速为1.0 mL ／ min；检测波长为 257 nm［9-11］；进样量为 20 μL；柱温为30 ℃；保留时间为10 min。供试品中EDTA-2Na 色谱峰的保留时间在7 ～9 min之间，分离度大于1.5的色谱条件为最适条件。

1.3.1 色谱柱的选择 因EDTA-2Na 与FeCl3反应生成的络合物与反相色谱柱上的非极性键合相之间有保留［7-8］，分别考察美国 Waters 及 Thermo 公司的C18 色谱柱。

1.3.2 流动相的优化

1.3.2.1 水相与有机相的比例 因络合物的极性较大，考察不同比例的水相与有机相（8 ∶2、9 ∶1、9.5 ∶0.5）对色谱条件的影响。

1.3.2.2 pH 络合物在酸性条件下稳定，考察流动相不同pH（2.0、2.4 及3.0）对色谱条件的影响。

1.3.2.3 磷酸盐确定 分别取浓度为0.005、0.01及0.02 mol ／ L 的磷酸二氢钠及磷酸二氢铵，加水溶解至1 000 mL，再加入0.4 mol ／ L 四丁基氢氧化铵60 mL，考察不同磷酸盐对色谱条件的影响。

1.4 溶液的配制

1.4.1 FeCl3溶液 称取0.06 g FeCl3，溶于预先用磷酸调pH 至2.4 的500 mL 超纯水中，配制为0.012%FeCl3溶液。

1.4.2 对照品储备液 精密称取EDTA-2Na 对照品100 mg，置100 mL 容量瓶中，用超纯水溶解摇匀并定容，配制为 1 000 μg ／ mL EDTA-2Na 对照品储备液。

1.4.3 对照品工作液 精密量取对照品储备液1、0.5、0.25 及 0.1 mL，分别至 50 mL 容量瓶中定容，配制浓度为 20、10、5、2 μg ／mL 对照品工作液。精密量取 10 μg ／ mL 对照品工作液 5、2.5、1、0.25 mL，分别至50 mL 容量瓶中定容，配制浓度为1、0.5、0.2、0.05 μg ／ mL 对照品工作液。

1.4.4 供试品溶液 取HAV20170302-原批供试品1 mL，加入 1 mL 0.012% FeCl3溶液，涡流混合 30 s，0.45 μm 滤膜过滤后备用。

1.4.5 空白溶液 取1 mL 超纯水，加入1 mL 0.012%FeCl3溶液，0.45 μm 滤膜过滤后备用。

1.5 方法的验证

1.5.1 系统适用性及专属性 取5 μg／mL 对照品工作液1 mL，加入1 mL 0.012% FeCl3溶液，涡流混合30 s，0.45 μm 滤膜过滤。按确定的色谱条件进样6 次，记录色谱图，测定理论塔板数及分离度。

1.5.2 线性范围 分别取 0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg／mL对照品工作液1 mL，加入0.012% FeCl3溶液1 mL，涡流混合30 s，0.45 μm 滤膜过滤，按确定的色谱条件进行检测。以对照品工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准工作曲线。

1.5.3 准确度 精密量取3 份HAV20170302-原批供试品各 1mL，分别加入 2、5、10 μg ／ mL 对照品工作液1 mL，再加入等体积的 0.012% FeCl3溶液，涡流混合30 s，0.45 μm 滤膜过滤后，按确定的色谱条件进行检测，计算加标平均回收率及RSD。接受标准：RSD ＜ 5% 。

1.5.4 精密度 精密量取6 份HAV20170302-原批供试品各 1 mL，加入 5 μg ／ mL 对照品工作液，再加入 1 mL 0.012%FeCl3溶液，涡流混合 30 s，0.45 μm滤膜过滤，按确定的色谱条件进行检测，验证重复性；次日由2 名试验员再次测定，验证中间精密度。计算平均EDTA-2Na 峰面积及RSD。接受标准：RSD ＜5%。

1.5.5 定量限及检测限 逐步稀释 5 μg ／ mL 对照品工作液，按确定的色谱条件进行检测。以信噪比（S ／ N）≥ 10 确定定量限，S ／ N ≥ 3 确定检测限。

1.5.6 耐用性 分别配制 pH 为 2.0、2.4 及 3.0 的流动相，取 5 μg ／ mL EDTA-2Na 对照品工作液，在每种流动相条件下进样6 次，计算色谱峰面积的RSD及相对误差（RE）。接受标准：RSD ＜ 5%，RE 在95% ～105%之间。

1.6 方法的应用 取3 批供试品，按1.4.4 项制备供试品溶液，按确定的色谱条件进样检测，记录峰面积，计算EDTA-2Na 残留量。

2 结 果

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 色谱柱 两厂家色谱柱上供试品中EDTA-2Na 的保留时间均为7 ～8 min、分离度均大于1.5、色谱峰对称性和柱效（理论塔板数大于10 000）均相似，均能达定量检测的要求，图略。综合考虑选用Thermo 公司的C18 色谱柱。

2.1.2 流动相

2.1.2.1 水相与有机相的比例 随着有机相比例的减少，EDTA-2Na 保留时间逐渐增加，水相与有机相比例为 8 ∶2、9 ∶1、9.5 ∶0.5 时，保留时间分别为5 ～ 6 、7 ～ 8 和 10 ～ 11 min，色谱峰分离度均大于1.5，图略。选择9 ∶1 为水相与有机相比例。

2.1.2.2 pH 流动相在 pH 为 2.0、2.4 及 3.0 条件下，供试品中EDTA-2Na 保留时间分别为5 ～6、7 ～ 8 和 10 ～ 11 min，分离度均大于 1.5，图略。选择2.4 为最适pH 值。

2.1.2.3 磷酸盐 磷酸二氢钠及磷酸二氢铵配制的流动相中，EDTA-2Na 的保留行为相近，二者浓度0.005、0.01 及 0.02 mol ／ L 时，保留时间均分别为4 ～ 5、7 ～ 8 和 11 ～ 12 min，分离度分别小于 1.5、大于1.5 和大于1.5，图略。综合考虑选择0.01 mol／L磷酸二氢铵为最适磷酸盐。

2.2 方法的验证

2.2.1 系统适用性及专属性 EDTA-2Na 对照品色谱峰的理论塔板数不低于10 000，分离度大于1.5，表明方法适用性良好。对照品溶液仅有EDTA-2Na色谱峰，无其他色谱峰干扰，空白溶液及供试品溶液未见该色谱峰，见图1，表明方法专属性良好。

2.2.2 线性范围 EDTA-2Na 对照品在 0.2 ～20 μg ／ mL 范围内，回归方程为 Y = 20 482.18 X +0.512 6，R2= 0.999 9，线性关系良好。标准曲线见图2。

2.2.3 准确度 3 个浓度加标样品的平均回收率分别为97.44%、100.6%及100.4%，RSD 为1.6%，见表1。表明方法准确度良好。

2.2.4 精密度 试验员A 重复检测6 次测得EDTA-2Na 峰面积的RSD 为1.4%；试验员A 及B 测得中间精密度的RSD 为1.6%。见表2。表明方法的精密度良好。

图1 空白溶剂（A）、对照品溶液（B）及供试品溶液（C）的高效液相色谱图Fig.1 HPLC profiles of blank solvent（A），reference（B）and test sample solution（C）

图2 EDTA-2Na 对照品的标准曲线Fig.2 Standard curve for reference for DETA-2Na

表1 加标样品的回收率（%）Tab.1 Recovery rates of spike samples（%）

表2 加标样品的精密度验证结果Tab.2 Precision test on spike samples

2.2.5 定量限及检测限 S ／ N 为 10 时，EDTA-2Na浓度为 0.2 μg ／ mL，即为方法的的定量限，S ／ N 为3 时，EDTA-2Na 浓度为 0.05 μg ／ mL，即为方法的的检测限。

2.2.6 耐用性 3 种pH 流动相检测6 次的色谱峰面积RSD 分别为0.24%、0.31%及0.18%；RE 分别为99.25%、99.12%及99.33%。见表3。

2.3 方法的应用 3 批供试品中均未检出EDTA-2Na。

表3 流动相的耐用性验证结果Tab 3.Validation for durability of mobile phase

3 讨 论

本研究建立了检测HA 灭活疫苗（MRC-5 细胞）中EDTA-2Na 残留量的 HPLC 法，根据 EDTA-2Na 与FeCl3在酸性条件反应生成络合物的性质，采用反向色谱法，用四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，调节流动相pH 值至酸性，考察磷酸二氢钠及磷酸二氢铵两种磷酸盐、不同浓度缓冲溶液（0.005、0.01 及0.02 mol ／ L）、水相与有机相不同比例、流动相的不同pH 值等条件，最终选择由0.01 mol ／ L 磷酸二氢铵缓冲液配制的四丁基氢氧化铵溶液作为水相，与乙腈比例9 ∶1 组成的流动相为最适条件［12］。本实验对流动相的不同pH（2.0、2.4 和3.0）进行分析，结果显示随pH 升高，待测物的保留时间逐渐增加，但各pH 条件下均能将待测物与杂质有效分离，且专属性良好，不干扰测定。但pH 为2.0 时已接近色谱柱的pH 耐受下限，长时间会影响色谱柱寿命，pH为3.0 时保留时间较长，影响分析效率。综合考虑选择2.4 为最适pH 值。

样品的前处理过程中需将配制好的酸性FeCl3溶液与供试品进行充分反应，生成稳定的络合物。本文将供试品进行充分旋涡混合，待反应完全后，再采用微孔滤膜过滤除去络合物沉淀及其他不溶性杂质，避免进样过程中堵塞色谱柱及色谱仪系统。

本研究成功建立了HA 灭活疫苗中EDTA-2Na 残留量的HPLC 检测方法，该方法具有良好的专属性、线性、准确度、精密度和耐用性，可用于测定本公司生产的HA 灭活疫苗（MRC-5 细胞）中EDTA-2Na 的残留量。