抗新型冠状病毒抗体样本盘在其胶体金测试卡质量评价中的应用

周志军 ，谢勇 ，岳胜兰 ，冯璐 ，梅宇 ，胡勇，李策生 ，何彦林 ，，李陶敬 ，周东波

1.国药集团武汉血液制品有限公司，湖北武汉430207；2.北京天坛生物制品股份有限公司，北京100024

新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）简称新冠肺炎，由新型冠状病毒（SARSCoV-2 ／ 2019-nCoV）感染引起。疫情暴发后，我国迅速进行SARS-CoV-2 抗体检测试剂的研制，并批准用其进行大规模检测，对疫情防控发挥了重要作用。其中新冠病毒（2019-nCoV）IgM ／ IgG 抗体检测试剂盒（胶体金法）是基于胶体金免疫层析技术，用于检测人血清、血浆和指尖全血样本中新冠病毒IgM 和IgG抗体，具有操作简单、无需专业设备、成本低、快速（15 ～ 20 min）等特点，可作为 SARS-CoV-2 核酸和影像学检测之外的一种有效补充检测方法。

国内SARS-CoV-2 抗体检测试剂类型较多，所用抗原有重组表达的 SARS-CoV-2 的 N、RBD、S1 及全长S 蛋白的1 种或2 种的组合，导致各厂家试剂检测结果不一致。目前，国际疫情仍较严峻，SARSCoV-2 检测试剂缺口较大，多个厂家处于相应诊断试剂研发和注册申报过程中。由于阳性样本不易获取，多数厂家在检测试剂研发过程中无法通过大量样本评测来评估测试卡质量。本研究采用COVID-19康复者恢复期灭活血浆制备的样本盘，用于检测多家胶体金测试卡，对其研发过程中优化前后的测试卡进行质量评估，并优化血清盘，以期提高胶体金厂家检测测试卡的质量。

1 材料与方法

1.1 2019-nCoV抗体胶体金测试卡 由三诺生物传感股份有限公司（厂家S，科研批S001、科研批S002）、杭州隆基生物技术有限公司（厂家L，科研批L001、科研批L003、科研批L005）及深圳市惠安生物科技有限公司（厂家H，科研批H001）提供。

1.2 2019-nCoV抗体检测试剂盒 2019-nCoV IgG 抗体检测试剂盒（ELISA）购自武汉科源安博生物技术有限公司（以下简称武汉科源，批号为202020217）、珠海丽珠试剂股份有限公司（以下简称珠海丽珠，批号为2020020308）及北京万泰生物药业股份有限公司（以下简称北京万泰，批号为NCOG20200203B）；2019-nCoV IgM 抗体检测试剂盒（ELISA）购自珠海丽珠（批号为2020020308）及北京万泰（批号为NCOM20200205B）；2019-nCoV 总抗体检测试剂盒（ELISA）购自北京万泰（批号为NCOA20200204B）；2019-nCoV IgG、IgM、总抗体抗体检测试剂盒（化学发光法）购自厦门万泰凯瑞生物技术有限公司（以下简称厦门万泰，批号分别为20200301、20200305、20200311）。

1.3 抗SARS-CoV-2 抗体样本盘的建立及优化

1.3.1 抗体阳性样本盘的确定 抗体阳性样本为COVID-19 康复者（均经SARS-CoV-2 核酸检测为阴性）病毒灭活血浆，共423 份，均采用武汉科源和珠海丽珠2019-nCoV IgG 抗体试剂盒（ELISA）检测。其中234 份样本除了采用上述两个厂家试剂盒检测外，另采用珠海丽珠的2019-nCoV IgM 抗体检测试剂盒（ELISA）检测，其中88 份样本还采用北京万泰生产的 2019-nCoV 总抗体［1］、IgG、IgM 抗体试剂盒（ELISA）进行检测。本研究所用珠海丽珠试剂盒包被的是N 蛋白，北京万泰和武汉科源试剂盒包被的是RBD 蛋白，两者任一项检测为阳性，均判为阳性，作为阳性盘样本，以此标准建立的阳性血清盘样本数为423 份（阳性样本盘1）。

1.3.2 抗体阴性样本盘的确定 采用职工复工筛查血清作为样本，均经北京万泰和珠海丽珠的2019-nCoV IgG、IgM 抗体检测试剂盒（ELISA）及武汉科源IgG 抗体检测试剂盒（ELISA）初筛，并经北京万泰生产的2019-nCoV IgG、IgM 抗体、总抗体检测试剂盒（化学发光法）进行复试。以初筛及复试均为阴性的100 份样本作为抗体阴性样本盘。

1.3.3 样本盘的优化 经ELISA 法和化学发光法检测，将阳性样本盘优化为涵盖 IgG（+）IgM（+）56 份、IgG（+）IgM（-）30 份，合计 86 份样本（阳性样本盘 2）。

1.4 抗体样本盘在2019-nCoV抗体胶体金测试卡质量评价中的应用

在试剂结合垫上包被胶体金标记的羊抗鸡IgY多克隆抗体和重组SARS-CoV-2 抗原，同时在NC 膜的检测区包被鼠抗人IgG 和IgM 单克隆抗体，质控区包被鸡IgY。将样本盘的样本进行编号，并标记于测试卡上，测试卡样本孔中加入10 μL 样本（血浆 ／ 血清），滴加2 ～3 滴稀释液；待测样本中SARS-CoV-2特异性抗体与胶体金标记的重组SARS-CoV-2 抗原结合，形成免疫复合物。若样本中含特异的SARSCoV-2 抗体，被检测区包被的鼠抗人单克隆抗体捕获，在检测区形成一条肉眼可见的条带（检测线）；游离的胶体金标记的羊抗鸡IgY 多克隆抗体继续向前迁移，与质控区包被的鸡IgY 发生特异性结合，在质控区形成一条肉眼可见的条带（质控线）。若样本中不含SARS-CoV-2 特异性抗体，则不出现检测线，仅出现质控线。根据鼠抗人IgG 和IgM 单克隆抗体包被的种类和位置，检测线可为1 条或2 条，若两者包被于同一位置，则检测线为1 条。

1.4.1 厂家S 采用厂家S 科研批S001 2019-nCoV抗体胶体金测试卡（金标抗原为重组表达SARS-CoV-2的S 和N 蛋白）检测阳性样本盘1（423 份）和阴性样品盘（100 份），计算样本盘1 和2 的检测结果一致性，用灵敏度表示，进行双样本t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。根据S001 批检测结果，对胶体金测试卡进行优化（金标抗原为重组表达SARS-CoV-2 的 RBD 和 N 蛋白，且上调鼠抗人 IgG 和IgM 包被浓度），即科研批S002。取阳性盘样本盘2（86 份），阴性盘92 份样本，用优化后批次（科研批S002）测试卡检测，并按下式计算准确度、灵敏度、特异性及正确指数。

准确度（总符合率）=（真阳性＋真阴性）／总样本量×100%；

灵敏度= 真阳性 ／（真阳性＋假阴性）× 100%；

特异性= 真阴性 ／（真阴性＋假阳性）× 100%；

正确指数（约登指数）= 灵敏度+ 特异性- 1

1.4.2 厂家L 采用厂家L 生产的科研批L001 2019-nCoV 抗体胶体金测试卡（胶体金标记抗原为重组表达的SARS-CoV-2 S1 蛋白，IgM 置于远离加样端，IgG 置于靠近加样端）检测血清盘2 中20 份IgG 阳性样本及14 份IgM 阳性样本，计算灵敏度（公式同1.4.1 项）；将IgM 和IgG 检测线顺序互换后（即科研批 L003），检测血清盘 2 中 52 份 IgG 和IgM 双阳性样本，计算灵敏度（公式同1.4.1 项），并比较灵敏度的变化。将胶体金标记抗原改为重组表达的SARS-CoV-2 受体结合域RBD 蛋白和核壳N蛋白，加样浓度设为 5 和 10 μL，并将 IgG 和 IgM 检测线重合，任一抗体阳性，检测结果即为阳性（即科研批L005）。采用科研批L005 总抗体胶体金测试卡检测血清盘2 中73 份SARS-CoV-2 抗体阳性样本，93 份抗体阴性样本，评价检测卡的灵敏度、特异性、准确度和约登指数（公式同1.4.1 项）。

1.4.3 厂家H 采用厂家H 生产的H001 批测试卡（标记抗原为重组表达的SARS-CoV-2 受体结合域RBD 蛋白和核壳N 蛋白）检测104 份SARS-CoV-2抗体 IgG 阳性样本，78 份 IgG 阴性样本；71 份 SARSCoV-2 抗体 IgM 阳性样本，111 份 IgM 阴性 IgG 阳性样本，评价检测卡的灵敏度、特异性、准确度和约登指数（公式同1.4.1 项）。

2 结 果

2.1 厂家S 胶体金测试卡检测 100 份阴性样本检测结果均为阴性，科研批S001 测试卡阴性背景清晰，检测线无条带，质控线条带明显，试验成立，见图1。科研批S001 测试卡检测阳性样本盘1 的423 份样本中，384 份为阳性，39 份为阴性。科研批S001 测试卡的准确度为92.54%，灵敏度90.78%，特异性为100.00%，约登指数为0.908，但阳性检测线颜色浅，不易辨识，见图2。科研批S001 测试卡检测阳性样本盘2 的86 份样本中，78 份为阳性，8 份为阴性，灵敏度为90.70%，阳性样本盘1 和2 灵敏性差异无统计学意义（t = 0.038，P = 0.969 7），表明可用优化的阳性样本盘2 代替阳性样本盘1，缩小样本盘，在不影响检测结果灵敏度的情况下，大幅减少工作量，且科研批S002 上调了抗人IgG 和IgM 的包被浓度，其阳性结果显色颜色深，清晰，易于判读，见图3。科研批S002 测试卡检测阳性盘样本2，其中82份为阳性，4 份为阴性；阴性盘92 份样本中，91 份为阴性，1 份为阳性。科研批S002 测试卡的灵敏度为95.35%，特异性为98.91%，准确度为97.19%，约登指数为0.943。

图1 厂家S 测试卡优化前（科研批S001）检测阴性样本结果Fig.1 Test result of negative samples by cassettes from manufacturer S before modification（Experimental Lot S001）

图2 厂家S 测试卡优化前（科研批S001）检测阳性样本结果Fig.2 Test result of positive samples by cassettes from manufacturer S before modification（Experimental Lot S001）

图3 厂家S 测试卡优化后（科研批S002）检测阳性样本结果Fig.3 Test result of positive samples by cassettes from manufacturer S after modification（Experimental Lot S002）

2.2 厂家L 胶体金测试卡检测 科研批L001 测试卡检测20 份IgG 阳性样本的结果为阳性，且显色明显，见图4；检测14 份IgM 阳性样本中，仅有2 份呈阳性，12 份漏检，灵敏度极低，为14.28%，漏检率较高，且显色不明显。优化后科研批L003 测试卡检测52 份IgG 和IgM 双阳性样本的结果目标条带显色明显，见图5，检测IgM 抗体的灵敏度为92.00%，灵敏度大幅提高。科研批L005 加样量为5 和10 μL 的检测结果均为阳性，前者的显色速度慢于后者，但均可在5 min 内显色，见图6，检测卡的灵敏度98.63%，特异性99.92%，准确度98.80%，约登指数0.985。结果需在15 ～20 min 进行判定，因此样本加入量的偏移不影响定性判断。

图4 厂家L 测试卡优化前（科研批L001）检测阳性样本结果Fig.4 Test result of positive samples by cassettes from manufacturer L before modification（Experimental Lot L001）

2.3 厂家H 胶体金测试卡检测 78 份IgG 阴性样本IgG 检测结果均为阴性，测试卡背景清晰无杂色晕染，目标条带显色明显，易于判读，见图7；104份IgG 阳性样本中，102 份为阳性，2 份为阴性。测试卡检测IgG 抗体的灵敏度为98.08%，特异性为100.00%，准确度为98.90%，约登指数为0.981。111份IgM 阴性IgG 阳性样本IgM 检测结果均为阴性，测试卡背景清晰无杂色晕染，目标条带显色明显，易于判读；71 份 SARS-CoV-2 抗体 IgM 阳性样本中，60份为阳性，11 份为阴性。见图8。测试卡检测IgM抗体的灵敏度为84.50%，特异性为86.49%，准确度为85.71%，约登指数为0.710。

图5 厂家L 测试卡优化后（科研批L003）检测阳性样本结果Fig.5 Test result of positive samples by cassettes from manufacturer L after modification（Experimental Lot L003）

图6 厂家L 测试卡优化后（科研批L005）检测阳性样本结果Fig.6 Test result of positive samples by cassettes from manufacturer L after modification（Experimental Lot L005）

图7 厂家H 测试卡检测IgG 阴性样本结果Fig.7 Test result of negative samples by cassettes from manufacturer H

图8 厂家H 测试卡检测IgM 抗体结果Fig.8 Test result of IgM by cassette from manufacturer H

3 讨 论

本研究采用的阳性样本盘均由COVID-19 康复者恢复期病毒灭活血清样本组成，所有样本均经SARS-CoV-2 核酸试剂检测为阴性，且经病毒灭活，血清盘的生物安全性具有良好保障。胶体金检测法具有操作简单，无需专用设备、不受场地人员限制、快速出结果等优点［2］。本研究发现，虽说明书中标明为15 ～20 min 判定结果，但测试卡检测阳性样本的线条最快1 ～2 min 即可显色，进一步证明该方法可用于快速检测。

研究显示，SARS-CoV-2 感染后3 ～7 d 即可产生 IgM 抗体，IgG 抗体的产生需要 10 ～ 15 d，在感染15 d 后，总抗体检出率达100%，抗体检测可用于疾病辅助诊断［3-4］。由于存在窗口期，胶体金抗体检测法不能单独用于疾病早期诊断，但可作为核酸检测、影像学检测等的有效补充，与上述方法结合可提高临床确诊效率。本研究结果表明，阳性样本盘IgG阳性占比明显优于IgM，由于IgM 是SARS-CoV-2 感染急性期产生，随着患者治愈出院，IgM 滴度逐渐下降，而IgG 抗体可在机体内存在较长时间。一项对SARS-CoV 的研究发现，感染SARS-CoV 12 年后仍可检测到其特异性抗体［5］。

厂家S 优化前科研批S001 金标抗原为重组表达SARS-CoV-2 的S 和N 蛋白，检测线显色浅，不易辨识。虽然是定性检测，显色深浅与测试样本中抗SARS-CoV-2 IgG ／ IgM 的量并无明确相关性，但检测线读取存在人为主观因素，不易辨识，会造成错判漏判。经本研究样本盘测试，结果反馈给厂家进行优化，S002 批金标抗原为重组表达SARS-CoV-2的RBD 和N 蛋白，且上调了抗人IgG 和抗人IgM 包被浓度。优化后测试卡检测线显色深，灵敏度提升。目前多家诊断试剂生产厂家均已选用RBD 和N 蛋白组合以提升产品质量。

厂家L 测试卡将IgM 设置于远离加样端，IgG设置于靠近加样端，结果IgM 检出率极低，分析原因可能为：根据胶体金层析技术原理，IgG 分子小，移动速度快，更易于与金标抗原结合，IgM 分子量大，金标抗原被IgG 结合后，导致IgM 结合金标抗原量减少；在层析过程中，由于IgM 检测线远离样本端，金标抗原IgM 复合物相对分子质量较大，需要运行距离长，金标抗原IgG 复合物优先被包被在靠近样本端的IgG 检测线的鼠抗人IgG 捕获，形成物理屏障，导致金标抗原IgM 复合物被拦截，到达检测线的复合物量减少。厂家L 根据上述结果进行调整，将IgM检出线调整至IgG 检出线下方，使IgM 检测线靠近加样孔端，优化后的检测卡IgM 检出率明显提升。

有研究测试了259 名感染SARS-CoV-2 有症状患者的早期样本（症状发作后75 d 内）和1 548 名在大流行前采集的血液样本，SARS-CoV-2 刺突（S）蛋白的受体结合域（RBD）的早期抗体反应的动力学显示，在患者症状发作开始的14 ～28 d 间，针对RBD 的IgG、IgA 或IgM 抗体反应均能准确识别最近感染的个体，特异性均为100%，灵敏度分别为97%，91%和 81%［6］。目前，针对 SARS-CoV-2 抗体及应用已有多项研究［7～10］，但新冠疫情仍在全球范围内持续，SARS-CoV-2 抗体检测试剂缺口仍较大。疫情期间，我国COVID-19 确诊患者在治疗期，血清样本存在病毒传染性风险，国家卫健委为生物安全性考虑，对医疗机构样本实施严格管控，禁止流出医疗机构，医疗机构承担着疫情防控及救治患者等任务，无法满足诊断试剂研发阶段频繁测试的需求。试剂厂家在研发诊断试剂过程中，需要多次调试优化，各厂家无法获得足够的阳性样本来调试试剂以兼顾敏感性和特异性，仅能用阴性样本调试保证阴性正确，尽量减少假阳性，避免应用后假阳性造成恐慌及不必要的医疗资源浪费和干预，但由于阳性检出率无法保证，可能造成漏检，对传染病疫情防控不利。

本研究采用阳性样本盘为康复者恢复期病毒灭活血浆样本，一方面为试剂厂家研发诊断产品提供支持，提高诊断试剂质量；另一方面通过对康复者恢复期血清样本的检测，完善对康复者恢复期血清的质量特征的了解，对基于血清衍生抗疫制品如COVID-19 人免疫球蛋白等防治用制剂的研发提供技术支持。胶体金测试还可作为后疫情时代大规模流行病学调查辅助方法之一，在未来新冠疫苗免疫效果观察和献浆员筛查中发挥作用。