鼠抗人间变性淋巴瘤激酶单抗及其试剂盒的制备及鉴定

沈怡 ，陈坚 ，袁克湖 ，陈才伟 ，马东晖 ，韦彦余 ，吴易潘，任琪，刘慧博，金坚

1.无锡傲锐东源生物科技有限公司，江苏无锡214000；2.江南大学药学院，江苏无锡214000

肺癌是世界范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，其发病率及死亡率分别达11.6%和18.4%［1］，严重影响人们的身心健康。所有肺癌中，非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）占 85%［2］。间变性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因是NSCLC 靶向治疗的重要靶点［3］。其中棘皮动物微管蛋白样4（Echinoderm microtubulin like 4，EML4）基因与 ALK 基因融合（EML4-ALK 基因）是ALK 基因重排最常见的一种形式，这种融合基因存在于NSCLC 中，参与肿瘤的发生发展过程［4］。因此，准确检测ALK 融合状态是ALK 阳性NSCLC 患者靶向治疗的前提。另外，有研究证明，NSCLC 中ALK的状态可能与患者的预后直接相关［5］。因此，需要一种质量高、成本低的ALK 重排筛选的方法。

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、全自动ALK 免疫组化化学试剂盒（Ventana IHC）及RT-PCR 是ALK 重排检测中推荐的方法，其中FISH 是ALK 重排检测的金标准。

CFDA 目前批准3 种用于诊断ALK 阳性NSCLC的方法，Vysis ALK Break Apart FISH 分离探针试剂盒、RT-PCR 试剂盒和全自动ALK 免疫组化化学试剂盒（Ventana IHC），三者的符合率很高［6］。而常规免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术简便易行、价格便宜且操作成熟，具有作为ALK 阳性NSCLC 的初筛方法的特性［7］。针对 EML4-ALK 融合基因靶点的抑制剂，科学家进行了大量的研究，ALK 靶向治疗的发展速度很快。克唑替尼是一种酪氨酸激酶受体激酶抑制剂，这种小分子抑制剂能有针对性地抑制ALK 激酶活性［8］。

常规手工 ／ 半自动IHC 检测ALK 与FISH 检测存在高度的一致性［9］。在IHC 检测中使用经济有效且敏感的抗体对ALK 重排基因进行预筛选具有重要意义。由于进口ALK 抗体处于垄断地位且价格昂贵，本研究以ALK 重组蛋白制备鼠抗人ALK 单抗及其试剂盒，并进行鉴定，旨在开发体外诊断ALK免疫组化试剂产品。

1 材料与方法

1.1 样本 1 162 份病理样本蜡块由3 家医院提供，样本信息见表1；NSCLC 临床病理组织蜡块（ALK 阴性NSCLC 及其癌旁组织、ALK 弱阳性NSCLC 组织、ALK 强阳性NSCLC 组织）由合作的医院提供。本研究方案均获得各医院伦理委员会批准。

表1 病理样本信息Tab.1 Data on clinical specimens

1.2 细胞及质粒 肺癌细胞系293T、H2228、A549及骨髓瘤细胞SP2 ／ 0 均购自ATCC，液氮保存，使用前复苏培养；质粒 ALK（真核 ／ 原核）、COG2、LOC-387885、C7orf46、OPRM1、BCL2L11、PIP5KL1、ANXA13、PXDNL、TMPRSS4、ZFYVE27 及 SERPI NB6 均由无锡傲锐东源生物科技有限公司提供。

1.3 实验动物 SPF 级 BALB ／ c 小鼠 4 只，雌性，6 ～8 周龄，体重约20 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：33000800000899。

1.4 主要试剂及仪器 人ALK 重组蛋白［人ALK 重组蛋白（NP_004295）片段（1 300 ～ 1 620 aa）：系以pET23a-N-His 为载体，人 ALK 蛋白 1 300 ～ 1 620 aa基因为目的片段，通过E.coli 表达纯化获得，浓度为 0.2 μg ／ μL；目的基因为 ALK 基因全长，在其表达蛋白C-端连有DDK 标签］及DDK 抗体由无锡傲锐东源生物科技有限公司提供；牛血清白蛋白（BSA）标准品和BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo 公司；F12 无血清培养基购自美国Gibco 公司；酶标羊抗鼠抗体购自美国Jackson 公司；单抗亚类检测试剂盒SBA Clonotyping System-HRP 购自美国 Southern-Biotech 公司；抗 ALK（D5F3）兔单克隆抗体试剂（IHC 法）购自瑞士Roche 公司；抗体稀释液分别购自美国Invitrogen 公司、基因生物科技有限公司及北京中杉金桥生物技术有限公司；抗原修复液及DAB 染色液（生物素-链霉卵白素法、聚合物法及增强聚合物法制备）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Sunrise 酶标仪购自瑞士Tecan 公司。

1.5 小鼠免疫及融合小鼠的选择 BALB／c 小鼠4 只经腹部皮下多点免疫人 ALK 重组蛋白，100 μL ／ 只，共免疫3 次，每次间隔2 周。初免抗原与等量弗氏完全佐剂混合；2 及3 次免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂混合。未次免疫后1 d，取眼周血，2 720× g离心10 min，分离血清，采用ELISA 法检测血清抗体效价。ELISA 板中包被人 ALK 重组蛋白，0.02 μg ／孔，血清倍比稀释后37 ℃孵育1 h；加入酶标羊抗鼠抗体（1 ∶5 000 稀释），37 ℃孵育 1 h；TMB 显色，1 mol ／ L硫酸终止反应，用酶标仪检测A450／ A630。选择血清稀释比为1 ∶12 800 时A 大于1.0 的小鼠进行细胞融合，融合前3 d 加强免疫1 次，仅免疫人ALK 重组蛋白，100 μg ／ 只。

1.6 细胞融合、阳性融合孔的筛选及阳性细胞的克隆化 取小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞，按常规方法进行细胞融合。待细胞长满孔底1 ／ 3 后，采用间接 ELISA 及免疫细胞化学（immunocytochemical，ICC）法检测细胞融合孔上清。ELISA 法同1.5 项，以A450／A630大于 1.0 的上清判为阳性。ICC 法：将H2228细胞接种至 96 孔板，1 × 104个 ／ 孔，依次用 4% PFA固定、3% H2O2灭活、0.1% Triton100 穿透，加入融合孔上清，37 ℃孵育1 h；加入酶标羊抗兔 ／ 鼠聚合物（DAB 染色液试剂盒组分之一），37 ℃孵育30 min；显色反应，倒置显微镜下观察细胞质，以显色为棕黄色的细胞判为阳性。采用有限稀释法筛选克隆阳性细胞3 次，细胞上清的检测及判定方法同阳性融合孔的筛选。各项检测均以空白试剂（缓冲液）为空白对照。

1.7 ALK 单抗的制备及纯化 将定株的杂交瘤细胞转瓶，培养至（3 ～ 5）× 105个、细胞活率大于 90%时，11 × g 离心 5 min；弃去原培养基，用无血清培养基洗涤，置 37 ℃，5% CO2培养箱中，10 r ／ min 转速孵育，当杂交瘤细胞总密度≥7×105个时，2 720×g离心10 min；收集细胞上清，2 ～8 ℃保存。采用间接ELISA 法及ICC 分别检测细胞上清的 A450／ A630和抗体特异性，方法同1.5 项。阳性细胞上清采用Protein G 亲和层析方法纯化。

1.8 ALK 单抗的筛选 采用IHC。将纯化的单抗1A4 用抗体稀释液稀释为 40、20 及 10 μg ／ mL，1H7及9H5 用抗体稀释液均稀释为40 μg ／ mL。以空白溶剂为空白对照，对NSCLC 进行检测。

1.9 ALK 单抗的鉴定

1.9.1 效价 采用 ELISA 法。ELISA 板包被ALK重组蛋白，0.1 μg ／ 孔。将单抗稀释至 1 mg ／ mL，从800 倍倍比稀释至819 200 倍，进行 ELISA 测定，方法同1.5 项。测定单抗的A450／ A630值，每孔进行3个重复，计算其CV。以A 大于1.0 的最大稀释比为抗体效价。

1.9.2 亚型 按单抗亚类检测试剂盒SBA Clonotyping System-HRP 说明书对单抗的Ig 类及亚类进行鉴定。

1.9.3 浓度 用BSA 标准品绘制标准曲线。将单抗样品稀释20 倍，加显色液，37 ℃ 孵育30 min；酶标仪波长550 nm 处读取吸光度值。

1.9.4 纯度 单抗进行8%～20%SDS-PAGE 分析。

1.9.5 亲和常数 采用间接ELISA 法。分别以1.6、0.8、0.4、0.2 μg ／ mL 人 ALK 重组蛋白包被微孔板，加入不同浓度（3.00、3.30、3.60、3.90、4.20、4.51、4.81、5.11、5.41、5.71 及 6.01 mg ／ mL）单抗及酶标羊抗鼠抗体（1 ∶1 000 稀释）。以不同浓度单抗的A450／ A630值为纵坐标，抗体浓度负对数为横坐标绘制曲线，计算抗体亲和常数Ka。

1.9.6 特异性

1.9.6.1 Western blot 复苏培养 H2228、A549 及293T细胞。将质粒 ALK、COG2、LOC387885、C7orf46、OPRM1、BCL2L11、PIP5KL1、ANXA13、PXDNL、TMPRSS4、ZFYVE27 及 SERPINB6 转染至 293T 细胞中培养，将H2228、A549 及过表达的293T 细胞裂解后的细胞悬液，5 550 × g 离心 10 min，取上清，用loading buffer 混匀，95 ℃水浴 10 min；经 8% ～ 20%SDS-PAGE 分离蛋白，转硝酸纤维素膜45 min，丽春红染色，封闭液封闭。293T 细胞分别加入DDK抗体（1 ∶1 000 稀释）及 ALK 单抗（1 ∶2 000 稀释），H2228 及 A549 细胞均加入 ALK 单抗（均 1 ∶5 000稀释），40 r ／ min 室温孵育 1 h；加入酶标羊抗鼠抗体（1 ∶5 000 稀释），室温孵育 1 h；曝光、显影及定影。

1.9.6.2 IHC 将临床病理组织石蜡片预热、脱蜡、梯度酒精水化；EDTA 修复液（pH 8.0）120 ℃高压修复2.5 min；3%双氧水中灭活15 min；加入ALK 单抗（1 ∶600 稀释），37 ℃孵育 1 h 或 2 ～ 8 ℃过夜；加入酶标羊抗兔 ／ 鼠聚合物，37 ℃孵育30 min；DAB显色液孵育5 ～10 min，苏木素体细胞染色液室温复染30 s；冲洗至返蓝，脱水、透明、封片，观察组织片染色结果。

1.10 ALK 单抗免疫组织化学试剂盒配套试剂的筛选

1.10.1 抗体稀释液 常规使用抗体稀释液加抗体配制即用型试剂，选用美国Invitrogen 公司、基因生物科技有限公司及北京中杉金桥生物技术有限公司的抗体稀释液与单抗配制后测试其性能，使用同一病例的ALK 强阳性NSCLC 组织蜡片，比较显色强度及背景着色情况。

1.10.2 抗原修复液及二抗系统 对目前最常用的3种条件抗原修复液［枸橼酸（pH 6.0）、EDTA（pH 8.0）及 EDTA（pH 9.0）］和 3 种二抗系统 DAB 染色液（生物素-链霉卵白素法、聚合物法及增强聚合物法）进行IHC 测试，使用同一病例的ALK 强阳性NSCLC组织蜡片，比较显色强度及背景着色情况。

1.11 ALK 单抗（1A4）试剂盒与抗 ALK（D5F3）兔单抗试剂（IHC 法）比较 分别将1 162 份病理样本蜡块切片，HE 染色，制成芯片蜡块，采用IHC 方法分别使用ALK 单抗试剂盒及对照试剂抗ALK（D5F3）兔单抗试剂（IHC 法）对芯片组织片进行染色，比较显色强度及背景着色情况，并计算阳性符合率、阴性符合率及总符合率（见表2），作为试验真实性及可靠性的评价，结果一致性分析采用Kappa 检验，α = 0.05检验水准下，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

表2 试验结果的评价Tab.2 Evaluation of test results

2 结 果

2.1 融合小鼠的筛选 3 只小鼠血清 A450／ A630大于1.0，符合要求，1 只不合格。

2.2 ALK 单抗细胞株的筛选 细胞融合后3 ～5 d，可见克隆细胞生长；ELISA 法检测有10 株细胞株上清 A450／ A630大于 1.0，判定为阳性；其中 3 株细胞株上清 ICC 染色呈阳性，分别命名为 1A4、1H7、9H5，见图1。

图 1 细胞株 1A4（A）、1H7（B）、9H5（C）上清及空白对照（D）的 ICC 染色结果（× 400）Fig.1 ICC staining results of supernatants of cell strains 1A4（A），1H7（B），9H5（C）and blank control（D）（× 400）

2.3 ALK 单抗的筛选 经ICC 检测，各浓度的1A4均呈强阳性，40 μg ／ mL 的 1H7 及 9H5 均呈弱阳性，见图2。表明1A4 在NSCLC 染色中特异性较强，选择1A4 进行后继试验。

图 2 单克隆抗体1A4、1H7 及 9H5 的 IHC 染色结果（× 200）Fig.2 IHC staining results of McAbs 1A4，1H7 and 9H5（× 200）

2.4 ALK 单克隆抗体1A4 的鉴定

2.4.1 效价 结果显示，各稀释倍数的单抗1A4 3个重复孔A450／ A630的CV 均 ＜10%，试验结果判定有效；单抗稀释比为 1 ∶51 200 时，A450／ A630均值为1.029，单抗效价为 1 ∶51 200。见表 3。

2.4.2 亚型 单抗1A4 属Ig2b 亚型。

2.4.3 浓度 BSA 标准品曲线方程为y=688.62 x-77.588，R2= 0.999 4，见图 3。单抗 1A4 稀释 20 倍后的 3 个复孔 A550分别为 0.602 5、0.609 1、0.605 7，浓度分别为 337.28、341.86 和 339.51 μg ／ mL。该单抗最终浓度为 6 791 μg ／ mL。

2.4.4 纯度 经 8% ～ 20% SDS-PAGE 分析，单抗1A4 在相对分子质量约25 000 及55 000 处可见清晰的轻重链条带，无杂带，大小与预期相符，见图4。表明抗体纯化效果良好。

表3 单抗1A4 的效价检测结果Tab.3 Determination rusult of titer of McAb 1A4

图3 BSA 标准品的标准曲线Fig.3 Standard curve for BSA

图4 单抗 1A4 的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of McAb 1A4

2.4.5 亲和常数 1.6、0.8、0.4 及 0.2 μg ／ mL 人ALK 重组蛋白抗原曲线见图5。亲和常数越高表示抗原抗体结合的紧密程度越高，经测定单抗1A4 的亲和力常数 Ka 为 2.75 × 109L ／ moL，表明单抗的亲和力较好。

2.4.6 特异性 经Western blot 分析，单抗1A4 仅识别ALK 蛋白，不识别ALK 之外的其他蛋白及A549细胞中的蛋白，能识别H2228 细胞系中的ALK 易位（相对分子质量约95 000）；DDK 抗体能识别过表达ALK 全长蛋白（相对分子质量约176 000）；单抗与11 种质粒均不发生交叉反应。见图6。IHC 染色显示，ALK 阴性NSCLC、ALK 阴性癌旁组织及空白试剂染色结果均为阴性，ALK 强阳性NSCLC 组织染色结果为强阳性，ALK 弱阳性NSCLC 组织染色结果为弱阳性。表明单抗1A4 特异性较好。

图5 单抗1A4 亲和力常数测定曲线Fig.5 Curve for determination of affinity constant of McAb 1A4

2.5 单抗1A4 在免疫组织化学试剂盒中的配套试剂

2.5.1 抗体稀释液 3 个厂家的抗体稀释液对单抗性能的影响基本一致，均有相同强度的组织细胞质染色，且无背景染色。选择成本最低的中杉金桥生物科技有限公司的抗体稀释液。

2.5.2 抗原修复液及二抗系统 结果显示，9 种条件测试下的组织均为细胞质染色，但染色强度和背景不同，EDTA 修复液（pH 9.0）与 DAB 染色液（增强聚合物法）条件下染色最强且无背景，选择二者作为配套的抗原修复液和二抗系统。见表4。

2.6 ALK 单抗 1A4 试剂盒与抗 ALK（D5F3）兔单抗试剂（IHC 法）比较结果 ALK 单抗 1A4 试剂盒与抗 ALK（D5F3）兔单抗试剂（IHC 法）检测 1 162 份样本的ALK 阳性、阴性及总符合率均为100%。两者的检测及诊断定性结果一致性良好（Kappa =1.000，P ＜ 0.001）。见表 5。

图6 各细胞裂解液中DDK 抗体及ALK 抗体特异性的Western blot 分析Fig.6 Western blotting of DDK and ALK antibodies in various cell lysates

表4 单抗1A4 配套修复液与二抗系统的测试结果Tab.4 Test results of repair solution and secondary antibody system matched to McAb 1A4

表 5 ALK 单抗（1A4）试剂盒及抗 ALK（D5F3）兔单抗试剂（IHC 法）检测结果Tab.5 Detection results by ALK McAb（1A4）kit and rabbit anti-ALK（D5F3）McAb kit（IHC）

3 讨 论

自 2011 年美国 FDA 及 2013 年中国 CFDA 批准克唑替尼治疗ALK 阳性的局部晚期或转移性NSCLC 以来，依靠 IHC 初筛 ALK 阳性的 NSCLC 病例。有研究表明［10］，克唑替尼作为NSCLC 患者的多靶点靶向治疗，具有良好的疗效及安全性，不良反应轻微。如患者确诊为临床ALK 阳性NSCLC，可接受克唑替尼治疗。

本文通过免疫、融合、制备鼠抗人ALK 单克隆抗体，经ELISA 和ICC 筛选出合格的杂交瘤细胞株，经IHC 筛选得到最适的ALK 单抗。该单抗经效价、亲和常数、纯度、浓度检测及亚型和特异性鉴定，确认其特异性强。筛选出适合ALK 单抗1A4 检测的抗体稀释液、修复条件及二抗检测系统。通过临床病理样本的检测结果发现，1A4 单抗检测试剂盒与抗 ALK（D5F3）兔单抗试剂（IHC 法）检测及诊断一致性良好，表明ALK 单抗（1A4）试剂盒可用于NSCLC中ALK 蛋白的检测。

研究表明，在595 例临床样本对比实验中，单抗1A4 的灵敏度优于抗ALK（D5F3）兔单克隆抗体试剂（IHC），可防止假阴性结果的产生［10］。本公司以ALK 单抗（1A4）为原料，通过对产品配方及配套试剂与已上市的同类产品进行对比，开发出体外诊断试剂产品，即间变性淋巴瘤ALK 特异性抗体试剂，该产品已通过临床实验，成功申报注册，已成为国内首个上市的国产ALK 免疫组化试剂产品。相信该产品能以高质量的品质和低廉的价格替代进口产品，在一定程度上减轻了患者经济负担，使患者能更加积极地接受治疗，早日康复，获得较高的生活质量。