沉默lncRNA CTD-2510F5.4抑制Huh-7人肝癌细胞增殖侵袭及RACGAP1表达

吴贤建,路 远，石 凤，王安民，张 亚，浦 涧

(1.右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院肝胆外科，广西 百色 533000)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌类型，也是全球第六大最常见的癌症[1]。肝癌被认为是导致癌症死亡的第二大原因，全世界每年有700 000多例肝癌死亡[2]。早期肝癌患者通常没有任何症状，大多数肝癌患者在晚期被诊断出来，因此预后较差，5年总生存率低于10%[3]。HCC肿瘤发生和发展的分子机制尚未完全了解，揭示这些问题有助于开发HCC的新诊断与治疗方法。

长的非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是长度超过200个核苷酸的非蛋白质编码RNA[4]。越来越多的证据表明，lncRNA参与了许多基因调控的基本过程，包括对miRNA功能的调节[5-7]，直接转录调控[8]，基因沉默和染色质结构修饰[9]。lncRNA在许多肿瘤发生和发展中起着至关重要的作用[10-12]。CTD-2510F5.4 是最近被发现在肺癌[13]与胃癌[14]中显著高表达的lncRNA，但CTD-2510F5.4在肝癌中的研究未见相关报道。本研究通过TCGA数据库分析、沉默试验，检测CTD-2510F5.4沉默对体外Huh-7肝癌细胞增殖、侵袭、凋亡及RACGAP1的表达的影响，以探讨CTD-2510F5.4在肝癌发生发展中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要仪器

Huh-7人肝癌细胞购自上海生科院，RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，CCK8试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司(FC101-03)，DMEM培养基购自Hyclone公司(SH30022.01), lipo 3000购自Thermo Fisher公司(货号：L3000015)，胎牛血清购自Gibco(42F7180K)，Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒购自Biolegend公司(640934)，迁移小室购自Coring公司(3422)，基质胶购自Coring公司(货号：354248)， CTD-2510F5.4 siRNA与阴性对照载体购自湖州河马生物科技有限公司，序列：5'-GCAATATAGCAAGACACTGACTCTA-3'， RACGAP1抗体(ab2270)与actin抗体(ab8226)购自abcam公司。

CO2培养箱购自Thermo Fisher公司(3111)，流式细胞仪购自BECKMAN公司(CogtoFLEX)，倒置荧光显微镜购自尼康公(DS-Fi3)。

1.2 实验方法

1.2.1TCGA数据库分析 本研究采用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)对TCGA数据库中肝癌(Liver hepatocellular carcinoma，LIHC)进行分析，其中肝癌样本369例，正常样本50例。针对肝癌与正常样本中 CTD-2510F5.4与RACGAP1表达进行统计分析，并统计CTD-2510F5.4与RACGAP1表达相关性。

1.2.2细胞培养与转染 Huh-7人肝癌细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养条件为5%CO2、37℃；胰酶消化后制成悬液，接种在细胞板中并进行后续处理。设计分组：CTD-2510F5.4沉默组与阴性载体对照组，使用lipo 3000将CTD-2510F5.4 siRNA和空载对照转染细胞，24 h后收集细胞进行后续检测。

1.2.3RT-PCR检测 各组处理后的细胞，加入20倍体积的TRIzol试剂进行裂解，用一次性注射器反复抽打细胞使得裂解充分，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，采用荧光定量PCR仪器进行检测。设计CTD-2510F5.4引物：GAPDH上游引物：5′- CCAGGTGGTCTCCTCTGA -3′，下游引物5′-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3′，RACGAP1上游引物：5′-AAGAGGTCTGACTGAGACAG-3′,下游引物：5′-GAAGGCTACAGATAGCATGG-3′采用2-ΔΔct法比较组间表达。

1.2.4CCK8检测 胰蛋白酶消化细胞，计数并以每孔中接种5×103个细胞，接种到96孔板中，每组3个重复。将包含CCK8试剂的100 μL培养基添加到每个孔中，并孵育4 h，吸出培养基，并添加150 μL二甲基亚砜以溶解，后将细胞置于酶标仪上，读取450 nm处的吸光值。

1.2.5流式检测凋亡 转染后的Huh-7细胞，每组3个复孔重复，1 500 r/min离心5 min后弃去上清，PBS 洗涤后重悬细胞，取细胞悬液 100 μL，加入5 mL Annexin V-7AAD染料进行染色15 min，后使用流式细胞仪进行检测。

1.2.6Transwell检测侵袭 无血清培养基重悬转染后细胞，加500 μL的含有10% FBS的培养基至下室，加300 μL已调节好细胞密度的细胞悬液(5×104个)至侵袭小室内；置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养48 h，取出小室，用4%多聚甲醛固定20 min，加500 μL结晶紫染色10 min，PBS冲洗100倍显微镜拍照。

1.2.7Western blot检测 转染后的细胞，在具有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解，通过8%的SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白。将蛋白转移到膜上，并用5%脱脂牛奶封闭。然后将膜与一抗(RACGAP1或actin)孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体孵育。用增强的化学发光试剂检测蛋白条带。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 TCGA数据库分析

通过TCGA数据库中肝癌与正常样本进行分析，CTD-2510F5.4在肝癌样本中显著高表达,见图1A;RACGAP1在肝癌样本中显著高表达,见图1B;CTD-2510F5.4与RACGAP1在TCGA数据库肝癌样本中表达正相关(r=0.85)，见图1C。

A: CTD-2510F5.4在TCGA数据库肝癌与正常表达；B：RACGAP1在TCGA数据库肝癌与正常表达；C：CTD-2510F5.4与RACGAP1在TCGA数据库肝癌中表达相关性图1 CTD-2510F5.4在TCGA数据库肝癌中的表达及与RACGAP1表达的相关性分析Fig 1 CTD-2510F5.4 is specifically and highly expressed in liver cancer cases from TCGA database and is positively correlated with RACGAP1 expression

2.2 CTD-2510F5.4沉默验证与增殖检测

转染后的细胞，转染效率均在90%以上，见图2A、2B。RT-PCR检测沉默组(si-CTD-2510F5.4)与对照组(NC)中CTD-2510F5.4表达，沉默组中CTD-2510F5.4相对表达为0.260±0.025，明显低于NC组中CTD-2510F5.4相对表达1.027±0.041(t=16.06，P<0.001)，沉默效率为76.7%，见图2C。沉默后CCK8结果提示，沉默组相对NC组细胞增殖被抑制(t=20.02，P<0.001)，见图2D。

A：转染后Huh-7细胞(白光，100X)；B：转染后Huh-7细胞(绿色荧光，100X)；C：RT-PCR验证沉默效率；D：CCK8检测；与对照组比较，***P<0.001 vs. NC。图2 CTD-2510F5.4沉默后抑制肝癌细胞增殖Fig 2 CTD-2510F5.4 inhibits the proliferation of liver cancer cells after silencing

2.3 CTD-2510F5.4沉默后促进凋亡

采用流式细胞仪检测CTD-2510F5.4沉默后凋亡变化，结果提示，沉默组(si- CTD-2510F5.4)凋亡率为(7.243±0.049)%，明显高于对照组(NC)的凋亡率(3.113±0.139)%(t=28.09，P<0.001),见图3，提示CTD-2510F5.4沉默可以促进肝癌细胞Huh-7细胞凋亡。

A：NC组；B：si-CTD-2510F5.4组；C：凋亡率统计图；与对照组比较，***P<0.001 vs. NC。图3 CTD-2510F5.4沉默后促进肝癌细胞凋亡Fig 3 CTD-2510F5.4 silencing promotes apoptosis of liver cancer cells

2.4 CTD-2510F5.4沉默后抑制侵袭

采用Transwell检测CTD-2510F5.4沉默后侵袭变化，结果提示，CTD-2510F5.4沉默组迁移细胞为(104.0±5.196)个，明显低于对照组(200.6±6.269)个(t=11.86，P=0.000 3)，见图4，提示CTD-2510F5.4沉默可以抑制Huh-7肝癌细胞侵袭。

A：NC组；B：si-CTD-2510F5.4组；C：凋亡率统计图，拍摄倍数 100×；***P<0.001 vs. NC。图4 CTD-2510F5.4沉默后抑制肝癌细胞侵袭Fig 4 CTD-2510F5.4 suppresses invasion of liver cancer cells after silencing.

2.5 CTD-2510F5.4沉默后抑制RACGAP1表达

为探讨CTD-2510F5.4对增殖侵袭的可能机制，CTD-2510F5.4沉默后采用RT-PCR与Western blot检测RACGAP1表达影响。结果显示，CTD-2510F5.4沉默组中RACGAP mRNA相对表达为0.236±0.023，明显低于对照组中的1.006±0.075 2(t=9.799，P=0.006)，见图5A，沉默组中RACGAP蛋白相对表达为0.591±0.020，明显低于对照组的0.934±0.088(t=3.789，P=0.019 3)，见图5B、5C。提示，CTD-2510F5.4沉默后抑制RACGAP1 mRNA与蛋白表达。

A：RACGAP1 mRNA表达；B:RACGAP1蛋白表达条带；C：RACGAP1蛋白表达统计图;*P<0.05,***P<0.001 vs. NC。图5 CTD-2510F5.4沉默后抑制RACGAP1表达Fig 5 CTD-2510F5.4 inhibits RACGAP1 expression after silencing

3 讨论

肝细胞癌是人类最普遍和最具侵略性的恶性肿瘤之一[15]。尽管目前使用了各种治疗方法，HCC的临床预后仍然很差，尤其是在这些具有淋巴结转移或晚期肿瘤的HCC患者中[16]。缺乏适用于HCC诊断和治疗的分子标记是早期诊断率低及临床预后差的主要原因[17]。迫切需要更好地理解与评估肝癌的发病，以开发更具疗效的靶标疗法。

近年来，lncRNA在肝癌中重要作用已有较多报道[18-20]。在胃癌[14]中，CTD-2510F5.4是一种与恶性表型相关的lncRNA。但CTD-2510F5.4在肝癌发生发展中的作用尚未见研究报道。本研究通过对TCGA数据库分析发现，lncRNA CTD-2510F5.4在肝癌高表达。沉默试验发现，沉默CTD-2510F5.4能抑制Huh-7人肝癌细胞增殖及侵袭，并促进凋亡。提示，lncRNA CTD-2510F5.4可能是肝癌的致癌lncRNA。

RACGAP1是Rac GTPase激活蛋白1，可以负调控Rho蛋白[21]，已被报道在多种肿瘤中具有重要作用[22, 23]。RACGAP1在肝癌中异常上调与肝癌的不良预后相关[24]。但CTD-2510F5.4与RACGAP1是否存在调控关系，目前尚不清楚。笔者对TCGA数据库研究及对CTD-2510F5.4沉默研究表明，lncRNA CTD-2510F5.4与RACGAP1表达呈正相关；抑制lncRNA CTD-2510F5.4可导致Huh-7人肝癌细胞的RACGAP1 mRNA与蛋白表达降低，提示RACGAP1可能是lncRNA CTD-2510F5.4的作用靶点。但lncRNA CTD-2510F5.4是否通过或如何通过RACGAP1影响肝癌细胞的增殖、侵袭及凋亡，尚需后续的进一步试验论证。

总之，本研究表明沉默lncRNA CTD-2510F5.4能抑制Huh-7人肝癌细胞增殖、侵袭，促进凋亡，并抑制RACGAP1表达。推测lncRNA CTD-2510F5.4可能是肝癌的致癌lncRNA，RACGAP1可能是lncRNA CTD-2510F5.4的作用靶点。这为进一步理解肝癌发病机制与开发诊断指标提供了参考。