VEGFb参与白藜芦醇促进面神经损伤大鼠神经再生

杨椋昕，凤麟飞，李 芳，刘泽婷，王元银

面神经麻痹是部分或完全丧失面神经功能，主要表现为面部表情肌群运动功能障碍，也称为面瘫[1]。当面部肌群瘫痪时，出现一系列感觉及运动障碍，如鼻唇沟消失，不能上提口角，眼睑不能闭合，不能皱眉，额纹消失等。

白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种天然存在于食物中的多酚化合物，因其在控制氧化应激、炎症和细胞死亡等多个靶点方面的益处而广为人知[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是Res对神经系统发挥有益作用的靶点之一[3]。Hermann et al[4]在两项独立研究中发现，Res提高了受损伤大脑中VEGF的表达水平，从而可能通过此缓解脑损伤。该实验通过构建大鼠面神经损伤模型研究Res对于面神经损伤后的神经再生的作用及VEGF在其作用机制中所扮演的角色。

1 材料与方法

1.1 实验动物36只清洁级成年雄性SD大鼠，7～8周龄，体质量180～200 g，购自安徽医科大学实验动物中心，常规饲料饲养，自由饮水，温度为22～25 ℃，12 h/12 h交替照明。

1.2 动物模型建立按随机分组原则将大鼠分为2组，损伤组(Crush组)(n=24)和假手术组(Sham组)(n=8)。Crush组为该实验主要研究模型，按照0.35 ml/100 g对大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行全身麻醉；麻醉显效后，无菌条件下对大鼠右侧面部进行解剖，切开皮肤，钝性分离到达肌层，沿面神经走向解剖，到达面神经干部位分离面神经，使用持针器夹持面神经干90 s构建面神经损伤模型。Sham组同样手术操作，但仅暴露面神经干，不进行损伤。两组术后用3-0丝线常规进行皮肤伤口的缝合。Crush组大鼠再随机分为3组：①对照组(Crush+Vehicle组)，损伤后仅使用对面神经损伤后无任何作用的盐水；②白藜芦醇组(Crush+Res组)，此组在损伤后使用Res(Cat V90038，美国Sigma-Aldrich公司)；③抑制剂组(Crush+Res+Axitinib组)，损伤后使用Res和VEGF信号抑制剂Axitinib(Cat S1005，上海Selleck公司)。

1.3 药物注射对Crush+Res组与Crush+Res+Axitinib组大鼠按照200 mg/kg腹腔注射Res，对照组注射生理盐水。Crush+Res+Axitinib组大鼠额外在右侧面部耳屏前使用微量注射器局部注射10 μmol/L的Axitinib 10 μl。所有药物注射，每日1次，持续10 d。

1.4 QPCR检测VEGFb及受体mRNA含量大鼠连续注射药物10 d后，通过腹腔过量注射10%水合氯醛致死。麻醉致死后剪下大鼠头部，迅速切开右侧皮肤取出右侧面神经干，称重后将其剪碎后按照每100 mg组织加入1 ml 的TRIzol试剂于匀浆器内充分研磨。使用NanoDropND-3OOO检测各面神经组织样本提取的mRNA浓度和纯度，然后使用RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒内的逆转录反应体系制备cDNA进行PCR的扩增，反应参数为：预变性95 ℃、1 min，95 ℃、20 s，60 ℃、1 min，40个循环。各基因扩增的引物序列见表1，各组mRNA的相对表达量通过2-ΔΔCt进行计算。

表1 基因引物序列

1.5 Western blot检测VEGFb及受体蛋白含量大鼠连续注射药物10 d后，致死后同QPCR的手术操作采集面神经组织，称重后在匀浆器中根据每100 mg加入1 ml RIPA裂解液(含1%PMSF)，充分研磨。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质后转移到PVDF膜，用5%BSA(美国Sigma-Aldrich公司)在室温下封闭1 h，将膜与稀释抗体置于4 ℃冰箱内孵育过夜。使用的VEGFb抗体属性为兔抗(1 ∶500, ab185696，英国Abcam公司)； VEGFR1抗体属性为兔抗(1：500，ab2350，英国Abcam公司)；VEGFR2抗体属性为兔抗(1 ∶400，26415-1-AP，美国proteintech公司)beta Actin抗体属性为兔抗(1 ∶1 000，ab8227，英国Abcam公司)。按照1:5 000用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗(#7074, 美国Cell Signaling Technology公司)，将膜置于二抗中在摇床上洗涤。参考相关说明书，使用ECL发光试剂盒来检测蛋白。设置适宜的曝光时间进行化学发光反应。使用ImageJ软件对曝光后的蛋白条带图灰度值进行统计分析。

1.6 免疫组化评估面神经损伤后神经再生情况大鼠连续注射药物10 d后，致死后同QPCR的手术操作采集面神经组织，放入4%多聚甲醛(PA)溶液固定。随后进行梯度脱水，将组织放入1×PBS溶液配制的10%、20%的蔗糖溶液依次浸泡2 h，最后放入1×PBS溶液配制的30%蔗糖溶液在4 ℃下过夜。梯度脱水后包埋切片，含驴血清的PBST孵育1 h，使用兔抗NF200 (1 ∶100, 美国Sigma-Aldrich公司)，在4 ℃下过夜。二抗标记使用的是含特定驴血清抗体的Alex Fluor 488 (1 ∶400, 美国杰克逊实验室)，置于室温下2 h。最后滴加荧光淬灭封片液，在激光共聚焦显微镜下观察，计算机获取数据，成像。

2 结果

2.1 大鼠术侧面神经损伤后面神经情况通过免疫组化评估大鼠面神经损伤后的形态学变化，结果显示，与Sham组相比，Crush+Vehicle组中NF200阳性的轴突数目明显减少，表明神经纤维已被损伤，即模型的建立成功。与Crush+Vehicle组相比，Crush+Res组中NF200阳性的轴突数目更多，说明神经纤维发生再生，即Res具有促进面神经损伤后的再生作用(图1)。

图1 3组大鼠面神经损伤后免疫组化结果 ×20 A：Sham组；B：Crush+Vehicle组；C：Crush+Res组

图2 各组大鼠中VEGFb、VEGFR1及VEGFR2的mRNA的表达水平

5.112、3.744、5.038)。以上的统计结果表明造模给药10 d后，Res提高了面神经中VEGFb、VEGFR1及VEGFR2蛋白的表达水平，而Axitinib也有效地抑制了Res提高VEGFb、VEGFR1及VEGFR2蛋白表达的作用，差异均有统计学意义。见图3。

2.4 Axitinib对大鼠术区面神经的神经再生作用的影响通过免疫组化评估Axitinib在大鼠面神经损伤后的作用，结果显示，与Crush+Res组相比，Crush+Res+Axitinib组的NF200阳性轴突数目明显减少，说明Res对神经再生的促进作用被Axitinib所抑制(图4)。

3 讨论

近些年来，Res在神经系统中的作用得到了广泛的研究。Res具有多种作用于靶细胞、细胞生理学和信号传导的药理学作用。Res可能在不同的器官或细胞中对相同的靶点显示出不同的效果。例如，Res已经被证明可以降低内皮细胞和肿瘤细胞中的VEGF表达。Res通过激活神经系统中的蛋白激酶B信号通路产生对神经的保护作用[5]，也有学者[6]证实Res可通过提高机体内蛋白激酶B磷酸化水平从而起到缓解肾脏损伤的作用。Res已被证明在治疗各种类型的中枢神经系统损伤中具有神经保护作用，包括中风、创伤性脑损伤、蛛网膜下腔出血和脊髓损伤等。此外，Res在周围神经损伤动物模型的治疗中也显示出了保护作用。例如Lindsey et al[7]发现Res通过长期给药显示出对受损视网膜神经节细胞树突的保护作用。

图3 各组大鼠面神经中VEGFb、VEGFR1和VEGFR2蛋白的表达水平

图4 Crush+Res组和Crush+Res+Axitinib组面神经的神经再生情况 ×20A：Crush+Res组；B: Crush+Res+Axitinib组

VEGF是Res对神经系统发挥有益作用的靶点之一[3]，近年来许多学者将VEGF作为神经再生的有效中介进行研究。VEGF可支持和促进再生神经纤维的生长和神经元存活[8-9]。Raimondo et al[9]证实VEGF和胰岛素样生长因子1联合应用可促进小鼠坐骨神经损伤模型中神经支配功能的恢复，与对照组相比，实验组小鼠在神经损伤后表现出更强的运动能力。Ding et al[3]证实了使用Res 10 d后，与损伤组相比，Res组大鼠在一系列关于坐骨神经运动功能的检测指标上都体现了运动功能的恢复。Ding et al[3]通过免疫组化发现，Res应用后促进了损伤后轴突的恢复和再生。其中，作为Res靶点之一的VEGF信号通路被激活，其中VEGFb和VEGFR1及VEGFR2蛋白和mRNA表达均提高。以上的研究结果提示在大鼠坐骨神经损伤模型中，Res可能是通过激活机体内的VEGF信号通路，提高了VEGFb mRNA与蛋白表达水平，最后达到促进神经再生以及运动功能恢复的作用。但是Res在面神经损伤模型中的作用及它是否影响VEGF相关的表达尚未得到研究。

本研究采用的是大鼠夹持损伤导致的面神经损伤模型，在面神经损伤后，使用Res可促进VEGFb与其受体VEGFR1和VEGFR2的表达，从而促进了神经再生的发生，且Res对于神经再生的有效作用可被VEGF抑制剂Axitinib所抑制。Res对于面神经损伤后的神经再生具有促进作用，且可能是通过激活机体内的VEGF信号通路使VEGFb和其受体VEGFR1和VEGFR2的mRNA和蛋白表达增加来实现这一作用。

本实验参考Ding et al[3]的文章，后续希望能够通过对Res使用剂量和时间的研究来完善补充Res和面神经神经再生之间的量效关系以及增加对照药物的实验来提高可信度及准确度。