轮状病毒感染BALB/c乳鼠乳糖不耐受模型的建立

章孝成，丁 锐，张晓燕，韩毛振，黄升海,

乳糖不耐受症(lactose intolerance，LI)是由机体内乳糖酶缺乏所引起，症状为腹部不适、胀气、和腹泻等。LI是由于机体内乳糖酶缺乏而引起的腹部不适、胀气和腹泻等临床症状。目前LI是影响儿童营养不良、发育迟缓的重要疾病，全球许多人群面临不同程度的LI，严重影响人们的生活质量[1-2]。继发性乳糖不耐受(secondary lactose intolerance, SLI)是一种暂时性LI，常继发于肠道各种病毒或寄生虫感染性疾病、克罗恩病或放射性肠炎等，使肠绒毛受损伤而出现乳糖酶的缺乏，发生LI腹泻；待绒毛恢复能分泌足量乳糖酶后疾病有所恢复[3]。目前，SLI的发生机制研究并不完善，主要原因是缺乏相关的SLI动物模型。该文通过构建轮状病毒(rotavirus,RV)感染7日龄BALB/c乳鼠SLI模型，为SLI的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株与病毒株恒河猴胚胎肾细胞MA104细胞株、轮状病毒VR-2018病毒株均购自武汉病毒研究所，课题组自行培养保存。病毒复苏后在MA104细胞上进行培养增殖，通过半数组织细胞感染剂量(median tissue culture infective dose，TCID50)测定感染剂量为10-4.51/0.1 ml后，用于灌胃感染乳鼠。

1.2 实验动物SPF级1～8周龄BALB/c小鼠36只，由安徽省实验动物中心提供，饲养于独立送风隔离笼具系统内，该系统由安徽医科大学基础医学院动物房提供，等级为P2级。待雌雄鼠自行配种生产乳鼠，随机选取150只7日龄BALB/c乳鼠，3.5 ～4.0 g/只。

1.3 主要试剂DMEM培养基购自美国Gibco公司(批号：1868817)；小牛血清购自芜湖天明生物技术有限公司(批号：C0257)；二甲基亚砜购自美国biosharp公司(批号：D5879)；乳糖酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所公司(批号：A082-1)；TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司(批号：15596-026)；逆转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒购自北京全式金公司(批号：AH311-02、AE411-02)；其他各种规格的培养板购自美国Falcon公司。

1.4 RV增毒及感染剂量测定MA104细胞经0.2%EDTA、0.25%胰蛋白酶消化后反复吹打混匀，制成5×105/ml细胞悬液；将细胞悬液接种到24孔细胞培养板，1 ml/孔，在24孔细胞培养板中生长24 h后，细胞单层达90%融合，吸弃培养液，用无血清MEM培养液洗涤2次；每孔加入100 μl含7 μg/ml胰酶的无血清MEM培养液，再加100 μl病毒悬液混匀，37 ℃培养吸附1 h，每隔20 min取出摇匀一次；吸弃接种液，细胞用无血清MEM洗涤2次后加入1 ml含7 μg/ml胰酶的无血清DMEM培养，置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养；逐日观察细胞生长状态，当80%以上细胞出现病变时收获病毒。收获的病毒悬液10倍连续稀释，经TCID50测定，RV病毒悬液中感染性病毒为1×10-4.51/0.1 ml。

1.5 RV感染模型的建立将BALB/c乳鼠随机分为3组：实验感染组、PBS阴性对照组和正常对照组，每组5只，实验感染组、PBS阴性对照组采用灌胃的方式接种，其中实验感染组接种TCID50为1×10-4.51/0.1 ml RV病毒悬液，200 μl/只，PBS阴性对照组接种等体积PBS溶液，正常组对照组不接种任何试剂，乳鼠于接种前后各饥饿2 h，每天观察乳鼠的腹泻情况。

1.6 样本的收集及检测接种后每日处死乳鼠，无菌取乳鼠小肠组织，通过qPCR方法检测病毒增殖水平，HE染色和乳糖酶活力检测，观察及检测乳鼠小肠组织中RV的含量及其组织病理变化。

1.7 qRT-PCR法收取乳鼠小肠组织，预冷PBS洗涤3次后用TRIzol试剂提取总RNA，测定其纯度和浓度后，按照EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒操作说明书配置逆转录反应体系和操作；靶cDNA按照TransStart Green qPCR SuperMix试剂盒操作说明书配置RT-PCR反应体系和操作。以GAPDH为本实验的内参。引物序列见表1。

表1 基因的引物序列及扩增片段长度

1.8 乳糖酶活力测定取新鲜的乳鼠肠组织匀浆，并测定其蛋白浓度，设立空白管、标准管、测定管和对照管4个实验管，各管先加入50 μl底物，空白管加入25 μl双蒸水，标准管加入25 μl浓度为5.55 mmol/L葡萄糖液，测定管加入25 μl乳鼠肠组织匀浆液，对照管不加任何物质，混均，37℃孵育20 min后各试验管加入25 μl终止剂，对照管加入与测定管相对应的25 μl乳鼠肠组织匀浆液，各试验管混均，4000 r/min离心10 min，取上清液备用，取96孔酶标板，加入8 μl上述的各试验管的上清液，每个试验管设立两个复孔，每孔加入200 μl显色剂，轻轻震荡孔板，37℃孵育15 min后，酶标仪505 nm处读取各孔吸光度(optical density, OD)值。通过公式：乳糖酶的活力(U/ mgprot )=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(5.55 mmol/L)/反应时间(20 min)/待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)×1 000

1.9 统计学处理使用SPSS22.0进行统计差异分析，实验数据均数通过One way ANOVA即单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RV的增殖轮状病毒VR-2018株感染正常MA104细胞后在细胞内增殖，病变细胞随着病毒不断复制和增殖而加重，细胞出现贴壁能力减弱、大量圆缩、悬浮、变形和破裂等现象，见图1。

图1 正常MA104细胞和RV感染的MA104细胞 ×400A：正常MA104细胞；B：RV感染的MA104细胞

2.2 qPCR检测乳鼠小肠组织内RV相对含量小肠组织中RV NSP5基因通过荧光定量PCR检测，结果显示，RV感染第一天在小肠组织中即可检测到，RV NSP5基因的mRNA表达含量呈现先升高后逐渐降低的趋势，前4 d在小肠组织中病毒的表达水平均较高，其中第二天最高(P=0.0174，F=13.69)，感染第7天以后相对表达水平很低，见图2。

图2 实验组乳鼠小肠组织RV NSP5基因mRNA表达

2.3 乳鼠攻毒后的腹泻情况乳鼠攻毒后每隔24 h观察其体征和腹泻情况，连续观察10 d并记录。按压乳鼠腹部产生应激排便，通过粪便的形态判断腹泻情况，腹泻的评分参考标准分成3个等级：未腹泻、普通腹泻和严重腹泻，通过观察乳鼠粪便形态进行分级，未腹泻：无便或正常固体粪便，记为0分或1分；普通腹泻：黄色颗粒状便，记为2分；严重腹泻：软便或水样便，记为3分。通过观察，正常对照组无腹泻情况，实验感染组感染后前3 d出现严重腹泻，腹泻持续约7 d左右。见图3。

图3 乳鼠腹泻结果

2.4 乳鼠小肠外观性状解剖乳鼠观察小肠组织外观性状：PBS阴性对照组和正常对照组小肠完整，表面光滑透亮；实验感染组小肠色泽较正常对照组灰暗，小肠上皮有很多出血点，见图4。

图4 乳鼠小肠外观性状A：正常对照组；B：PBS阴性对照组；C：实验感染组

2.5 乳鼠小肠组织切片HE染色取实验感染组，正常对照组和PBS阴性对照组小肠组织进行HE染色。正常对照组和PBS阴性对照组整体状态一致，小肠各层结构完整清晰，细胞胞质致密，绒毛排列整齐完整；实验感染组乳鼠肠组织出现病变，表现为空泡，细胞水肿，有炎性细胞浸润，小肠绒毛中分布的血管扩张充血，绒毛出现破损杂乱，绒毛长度较对照组变短。见图5。

2.6 乳糖酶活力检测与正常对照组比较，实验感染组的乳糖酶活力在前4 d逐渐降低，第2天开始，差异有统计学意义(P=0.0173，F=11.26)，在第4天达到最低(P<0.01，F=15.88)，第5天后逐渐恢复到正常对照组水平。见图6。

图5 BALB/c乳鼠小肠组织 HE ×400

图6 实验组乳鼠小肠组织乳糖酶活力检测

3 讨论

RV是引起全球范围内儿童腹泻的主要病原体，主要经消化道传播，是导致SLI的原因之一[4]。目前，关于RV导致腹泻的动物模型相关报道很多，如牛、狗、猪、兔、羊和鼠等，其中由于鼠易获得、易饲养、繁殖能力强等优点在很多的动物模型中被广泛应用[5]。RV感染人体后在机体肠道的小肠上皮绒毛上端复制，使得肠上皮基底膜中粘连蛋白疏松，导致细胞间连接紧密性下降、小肠上皮微绒毛细胞骨架结构破坏，乳糖酶活性表达下降，进而引起腹泻等一系列临床症状。BALB/c乳鼠因动物体质量轻，易获得，所用的病毒剂量小，实验成本低，适合批量建模；BALB/c乳鼠能够模拟婴幼儿RV感染急性肠炎的临床特征，可快速构建病毒感染动物实验模型，实验稳定性好，可重复。RV病毒感染方式为粪-口途径传播，故本实验采用灌胃感染病毒，为排除人为操作等因素对小鼠机体损伤的干扰,设置PBS阴性对照组表明实验的科学性与严谨性。RV感染后前3 d出现严重腹泻，腹泻约持续7 d左右，对照组阴性，表明病毒的感染能导致乳鼠腹泻。HE染色结果显示RV感染小肠组织后，小肠组织损伤、小肠绒毛结构破坏，出现水肿等炎症反应，从病理学角度证明RV感染会导致小肠组织发生炎症，进而引起位于肠上皮细胞刷状缘上端的乳糖酶活性降低。通过乳鼠小肠组织乳糖酶活性检测，表明RV感染后会影响到乳糖酶活性且使其降低。乳鼠乳糖酶活性的降低和出现腹泻临床症状表明乳鼠产生SLI。从病理结构来看，乳糖酶的活性和数量在空肠中最高，而RV主要侵袭小肠黏膜上皮细胞刷状缘上端，使得肠上皮细胞发生空泡化，出现水肿和绒毛断裂脱落的现象，致使小肠黏膜损伤，小肠组织结构破坏，严重影响到小肠黏膜吸收水分和电解质功能，从而引起腹泻且使得乳糖酶的数量和活性降低[6-7]。本课题组的模型研究结果与之一致。