高效液相色谱荧光及二极管阵列检测器检测血清中维生素A、E的方法学比较

贾永娟，刘杏立，雒 琴，王小兰，倪君君

北京和合医学诊断技术股份有限公司，北京 100011

维生素A(VA)和维生素E(VE)都属于脂溶性维生素，是维持人体正常生理功能所必需的营养物质，且不能在人体内合成，需从食物中获取[1-2]。VA具有促进生长发育、增强抵抗力、预防夜盲症以及癌症等作用，且对骨骼牙齿的发育和皮肤的光滑程度有着重要影响[3]；VE具有抗衰老、护肤以及抑制肿瘤等功效，并对习惯性流产、动脉粥样硬化等起到预防作用[4]。但是体内VA、VE水平过高或过低均不利于身体健康[5-6]。因此，开发用于检测血清中VA、VE水平的快速、高效的方法对及时调节体内VA、VE水平是十分必要的。

近年来，VA、VE的检测方法主要有分光光度法[7]、气相色谱法[8]、液相色谱法[1,9-10]和质谱法[11-12]等。其中，高效液相色谱法以灵敏度高、操作简单、设备便宜易推广的优势已成为检测VA、VE的主要方法。高效液相色谱法检测又分为二极管阵列检测器(DAD)检测法和荧光检测器(FLD)检测法，但是鲜有报道对两种方法进行详细对比。本研究分别用这两种检测器(DAD、FLD)对血清中的VA、VE进行检测，并在线性关系、精密度、准确度等方面进行比较，结果发现两种检测器均适用于检测人血清中VA、VE水平，检测结果无明显差异，现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器 高效液相色谱仪、荧光检测器、二极管阵列检测器(日本岛津仪器有限公司)，紫外分光光度计[尤尼柯(上海)仪器有限公司]，多管涡旋混合器(北京踏锦科技有限公司)，离心机(Sigma公司)，氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器股份有限公司)。

1.2试剂 VA、VE标准品(Sigma公司)，VA、VE乙酯(Sigma公司)，蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)，无水乙醇(天津市光复精细化工研究所)，正己烷(北京颐丰天成科技有限公司)，甲醇(默克股份有限公司)。

1.3色谱条件 荧光检测器的色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8 (2.1 mm×50.0 mm，5 μm)，流动相为甲醇/水，流速1 mL/min。荧光检测器检测VA和VE的激发和发射波长分别为325、294 nm 和470、328 nm。二极管检测器的色谱柱为Waters SunFireTMC18 (2.1 mm×100.0 mm，3.5 μm)，流动相为甲醇/水，流速0.3 mL/min，检测VA和VE的波长分别为325 nm和292 nm。

1.4血清标本预处理 将100 μL血清及其内标溶液置于1.5 mL的离心管中，加入100 μL蒸馏水稀释，涡旋；再依次加入无水乙醇、正己烷，涡旋，离心；取上清液并吹干，加入100 μL甲醇复溶，涡旋溶解；放入棕色瓶中备用。

1.5方法学比较

1.5.1线性关系 配制系列水平的VA和VE标准品溶液，分别用FLD和DAD进行色谱分析，建立标准曲线。

1.5.2精密度 取适量配制好的供试品溶液，连续进样6次，再分别用DAD和FLD进行检测分析。

1.5.3回收率 在血清标本中添加3种水平(VA 0.125、0.5、2.0 mg/L，VE 1.25、5.0、20.0 mg/L)的标准溶液(简称加标)，按照血清标本预处理步骤进行回收试验，空白对照标本及每个水平加标标本重复3次，并分别用FLD和DAD进行检测。

1.5.4残留 取高水平的供试品溶液，用FLD和DAD进行检测分析；分析结束后，再对一份空白溶剂(甲醇)进行检测。

1.5.5DAD和FLD的一致性和相关性 取正常16份血清进行预处理制备供试品溶液，并用FLD和DAD进行检测，釆用Medcalc18.5统计学软件，使用Bland-Altman点图法分析FLD、DAD两种检测方法的一致性；Passing-Bablok回归法分析相关性。

1.6统计学处理 釆用Medcalc18.5统计学软件，使用Bland-Altman点图法分析FLD、DAD两种检测方法的一致性；Passing-Bablok回归法分析相关性。

2 结 果

2.1线性关系 建立的标准曲线结果如表1所示，线性相关系数(r)在0.999以上。

表1 FLD和DAD检测血清中VA、VE的线性方程

2.2精密度 供试品溶液连续进样6次，结果如表2所示：FLD、DAD检测时，VA的相对标准偏差(RSD)为0.18%、0.91%；VE 的RSD为1.19%、0.49%。

表2 FLD和DAD检测血清中 VA、VE的精密度

2.3回收率 空白标本和3种加标水平标本的检测结果如表3所示：FLD检测法的回收率为89.9%～104.7%，RSD≤3.60%；DAD检测法的回收率为91.7%～103.2%，RSD≤2.91%。

表3 FLD和DAD检测VA、VE的加标回收分析

续表3 FLD和DAD检测VA、VE的加标回收分析结果

2.4残留 残留的考察结果显示，目标分析物在色谱图的相应保留时间处均未出现目标峰。

Passing-Bablok回归法分析结果如图2和图3：VA的回归直线方程为Y=-0.006 723 +0.970 2X，斜率B为 0.970 2(95%CI:0.913 5～1.045 3)，截距A为-0.006 723(95%CI:-0.042 05～0.026 16),P=0.49。VE的回归直线方程为Y=-0.489 6+0.992 4X，斜率B为0.992 4(95%CI:0.940 1～1.049 5)，截距A为-0.489 6 (95%CI:-1.329 5～0.203 1)，P=0.49。由此结果可得：VA、VE回归直线的斜率95%CI均包含1，截距的95%CI均包含0，P>0.05。

表4 FLD和DAD检测16份血清中VA、VE水平的实验数据(mg/L)

注：A为FLD图，B为DAD图。

注：A为Bland Altman点图，B为Passing-Bablok图。

注：A为Bland Altman点图，B为Passing-Bablok图。

3 讨 论

VA、VE作为重要的脂溶性维生素，是人体所必需的微量营养物质。正常情况下，健康人群血清中VA 水平为0.30～0.36 mg/L，VE水平为5.0～20.0 mg/L，儿童血清中的VE水平稍低，平均为(5.3±1.3)mg/L[4]。近年来，越来越多的研究表明，VA的缺乏和水平降低会增加婴幼儿常见哮喘性疾病发生的风险[13]；VA、VE水平对孕妇和胎儿的健康起着至关重要的影响[14]。因此，人体内VA、VE水平的检测对预防婴幼儿疾病以及孕妇的营养指导等具有一定的临床意义。

目前，VA、VE的检测方法已有10余种。比色法：通过显色反应定量，简单、快速，但显色不稳定且干扰大，现已不常用；分光光度法：作为过去常用的方法，成本低、设备简单、易推广，但只能测定总含量，不能定量各同分异构体及其同系物，选择性差；荧光法：根据荧光强度定量，特异性强、干扰少、灵敏快速简单，但测定值与总VE值有偏差，更适用于检测以α-VE为主体的标本；电化学法、色谱法：快速、灵敏、高效，现已成为常用的分析手段。而色谱法中的高效液相色谱法已成为VA、VE检测的主流，其突出特点：(1)快速、高效，可同时分离包括同分异构体在内的多种化合物；(2)灵敏、特异性强，可用FLD、DAD等；(3)操作简单、快速。

因此，本文建立了高效液相色谱法对血清中的VA、VE水平进行检测，并将高效液相色谱法的FLD和DAD进行了对比，结果显示：在考察范围内，FLD和DAD的检测结果均呈现出良好的线性关系，且表现出良好的精密度以及良好的相关性和一致性。所以两种高效液相色谱法均适用于检测血清中VA、VE水平。然而，从检测色谱图中可以看出，FLD比DAD分析时间短、专属性强、基质干扰较少。因此，FLD更能满足临床标本周期短、批量检测的要求，且节能、高效。