复方黄柏液涂剂对中波紫外线致HaCaT细胞急性光损伤的修复作用*

黄艳丽，钱丽洁，陈凤娟，王 雄

上海交通大学附属上海市第六人民医院东院皮肤科，上海 201306

到达地球表面的紫外线包括UVA(320～400 nm)和UVB(290～320 nm)。虽然UVB只占0.5%，但在同等剂量下对皮肤的损伤量是UVA的1万倍。紫外线辐射后急性皮肤光损伤包括日晒红斑和黝黑反应，可有红斑、水疱等表现。目前UVB所致急性皮肤光损伤具体机制不明确，研究认为氧化损伤起重要作用。防晒剂和抗氧化剂的协同使用是机体光防护的主要方法，天然抗氧化剂是近些年研究的热点[1]。中药提取物是天然抗氧化剂的重要来源，目前已有研究证实五味子、肉豆蔻、黄柏、黄芪、麦冬、金银花、红景天等具有抗皮肤光老化作用。复方黄柏液涂剂主要组分为黄柏、连翘、金银花等中药，有清热燥湿、泻火祛腐功用，临床上适用于疮溃疡后、伤口感染等症状[2]。李慎新等[3]比较了几种中草药的抗氧化活性，发现黄柏和连翘抗氧化活性优于其他几种中草药。本研究旨在通过UVB照射建立永生化人表皮角质形成细胞(HaCaT细胞)急性光损伤模型，初步探讨复方黄柏液涂剂是否有光防护作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器 复方黄柏液涂剂(山东汉方制药有限公司，国药批号Z10950097)； HaCaT细胞(武汉大学中国典型培养物保藏中心)； CCK8(日本同仁公司)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化物酶(CAT)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒及基质金属蛋白酶-1(MMP-1)试剂盒均购自碧云天生物科技；UVB光疗仪(Sigma公司)；酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1HaCaT细胞培养 将含10%FBS的DMEM培养液加入HaCaT细胞培养瓶，在100%湿度、5% CO2、37 ℃的培养箱中培养。取3～8代对数生长期的HaCaT细胞，0.25%胰蛋白酶消化后传代接种于96孔板上，密度约为105个/mL。

1.2.2复方黄柏液处理浓度 将复方黄柏液涂剂分别按1∶10、1∶30、1∶50、1∶100、1∶200稀释加入HaCaT培养板，继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，在酶标仪上选择450 nm波长处测定各孔的吸光度值，检测波长450～490 nm，参比波长600～650 nm。

1.2.3实验分组及HaCaT细胞急性光损伤模型建立 将培养的HaCaT细胞分为对照组、模型组、实验组。对照组为正常培养的HaCaT细胞，不作任何处理。模型组HaCaT细胞接受不同剂量UVB照射，其中光疗仪灯管距离培养板15 cm，UVB照射剂量分别为10、20、30 mJ/cm2，PBS覆盖细胞上层，UVB照射结束后继续培养[4]。实验组HaCaT细胞采用1∶100稀释复方黄柏液培养6 h，96孔板中HaCaT细胞达到95%融合时，然后接受10、20、30 mJ/cm2剂量UVB照射。

1.2.4观察指标 (1)HaCaT细胞增殖率：各组HaCaT细胞培养24 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液，继续孵育4 h后，在酶标仪上选择450 nm波长处测定各孔的吸光度值。(2)LDH、SOD及CAT水平：采用比色法测定，细胞培养24 h后收集上清液，依据LDH、SOD、CAT及MMP-1试剂盒说明书，计算各组LDH、SOD、CAT及MMP-1水平。

2 结 果

2.1UVB诱导HaCaT细胞急性光损伤模型 正常培养条件显微镜下HaCaT细胞表现为贴壁生长的不规则细胞，数量较多(图1)，随着UVB剂量增加，细胞开始变形，细胞碎片增多，细胞数量逐渐较少(图2)。

图1 正常培养条件下HaCaT细胞(×100)

图2 30 mJ/cm2UVB照射下HaCaT细胞(×100)

2.2复方黄柏液处理浓度 CCK8法检测结果表明，空白组细胞增殖率为(87.433±3.761)%，复方黄柏液稀释组中1∶10组、1∶30组、1∶50组、1∶100组、1∶200组HaCaT细胞增殖率分别为(70.932±4.131)%、(74.597±4.822)%、(78.325±3.063)%、(85.875±3.314)%、(86.075±3.225)%。其中1∶10组、1∶30组、1∶50组HaCaT细胞增殖率显著低于空白组(P<0.05)，复方黄柏液抑制HaCaT细胞增殖。1∶100组和1∶200组HaCaT细胞增殖率与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)，考虑复方黄柏液的有效浓度，后续实验采取的浓度为复方黄柏液按1∶100稀释。

2.3各组上清液LDH、SOD、CAT水平及细胞增殖率 对照组中HaCaT细胞培养上清液LDH水平显著低于模型组和实验组，SOD、CAT水平及细胞增殖率显著高于模型组和实验组。实验组和模型组中随着UVB剂量逐渐增加，HaCaT细胞培养上清液LDH水平显著提高，SOD、CAT水平及细胞增殖率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。同一UVB剂量下，模型组LDH水平显著高于实验组，SOD、CAT水平及细胞增殖率显著低于实验组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同UVAB剂量下各组HaCaT细胞培养上清液LDH、SOD、CAT水平及细胞增殖率的比较

2.4各组上清液MMP-1水平 在同一UVB剂量下，实验组HaCaT细胞MMP-1水平比模型组明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。UVB照射的实验组和模型组HaCaT细胞培养上清液MMP-1水平均高于对照组[(5.763±0.592)ng/mL]，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组HaCaT细胞培养上清液MMP-1水平

3 讨 论

皮肤是人体最大的器官，具有屏障作用和免疫功能，是防御各种物理性、化学性损伤的第一道防线。皮肤光损伤不仅影响皮肤美观，还与多形性日光疹、慢性光化性皮炎、日光性荨麻疹、皮肤癌等疾病相关，容易对人们生活质量造成负面影响，因此如何更好地预防光损伤一直是皮肤研究领域的热点。UVB辐射引起的皮肤急性光损伤机制主要包括细胞凋亡、氧化应激、脂质蛋白作用、DNA损伤修复、线粒体损伤，其中氧化应激起重要作用。UVB辐射导致大量活性氧簇(ROS)产生，激活氧化应激通道，调控炎症因子及抗氧化物酶等表达。清除ROS，维持ROS与抗氧化酶动态平衡，减轻氧化应激损伤[5]。此外，光损伤可造成皮肤胶原降解，基质金属蛋白酶(MMPs)是调节胶原降解的重要因素。MMP-1为MMPs家族中降解胶原蛋白活性最高的酶，UVB照射可以诱导HaCaT分泌MMP-1增多[6]。角质形成细胞为皮肤吸收UVB的主要细胞，HaCaT细胞是人皮肤良性角质形成细胞的永生化细胞株，常用于替代表皮角质形成细胞做体外实验研究。研究发现姜黄素、茶多酚、补骨脂素、枸杞多糖等中药提取物能提高机体抗氧化能力，防御HaCaT细胞光老化[7-9]，对中药抗皮肤氧化的研究可扩展天然抗氧化剂的选择范围。

SOD及CAT作为重要的抗氧化物质，可减少细胞内氧化应激产物及活性氧的产生。而紫外线可抑制抗氧化酶活性，过量的活性氧使细胞膜的脂质双层结构氧化，提高细胞膜通透性，细胞内LDH可通过细胞膜渗出到上清液中，血清LDH水平是反映HaCaT细胞膜氧化损伤程度的重要标志。本研究结果显示，在同一组别中，随着UVB剂量增加，LDH水平显著升高，SOD、CAT及细胞增殖率显著降低，这与此前研究结果类似[5]，细胞氧化损伤程度与UVB剂量相关。本研究也发现在同一剂量UVB照射下，相比模型组，复方黄柏液显著降低SOD、CAT水平及细胞增殖率，提高LDH水平，说明复方黄柏液可显著提高HaCaT细胞抗氧化能力，减轻细胞膜氧化应激损伤，进而提高细胞增殖率。本次实验中发现，UVB照射组与对照组比较，MMP-1表达显著增多，在同一UVB剂量下实验组HaCaT细胞MMP-1水平比模型组明显减少，说明复方黄柏液可以抑制UVB诱导的MMP-1分泌，减少UVB对组织的损伤，但对其具体信号通道作用仍需进一步研究。

复方黄柏液中黄柏和连翘为君药，金银花、蒲公英为臣药，具有清热泻火、消肿祛腐功效。有研究发现黄柏中黄酮类化合物含量丰富，可清除自由基和超氧阴离子，具有较强的抗氧化作用[10-11]。连翘提取物中的总黄酮、绿原酸、连翘酯苷、芦丁等具有抗氧化抗衰老等作用[12]。金银花、蒲公英中也有多种抗氧化活性分子，包括绿原酸、黄酮、挥发油等[13-14]，二者均可吸收紫外线，具有较强的防晒能力。所以复方黄柏液可能通过上述抗氧化分子对HaCaT细胞进行光防护作用。

本次研究初步发现复方黄柏液可能对UVB照射HaCaT细胞造成的急性光损伤具有防护作用，但对具体细胞信号通路作用未明确，之后将对炎症细胞因子及细胞衰老凋亡相关蛋白等进行进一步研究。复方黄柏液在皮肤应用范围较广，对湿疹、接触性皮炎、脂溢性皮炎、带状疱疹、中毒性表皮松解症具有显著效果[15-16]，对皮肤无明显刺激作用，安全性高，可进行更多的研究，使其更好地用于临床工作中。